环境科学  2014, Vol. 35 Issue (5): 1968-1973   PDF    
引用本文
王淑玲, 张玉喜, 刘汉柱, 辛华. 氧化铜纳米颗粒对水稻幼苗根系代谢毒性的研究[J]. 环境科学, 2014, 35(5): 1968-1973.
WANG Shu-ling, ZHANG Yu-xi, LIU Han-zhu, XIN Hua. Phytotoxicity of Copper Oxide Nanoparticles to Metabolic Activity in the Roots of Rice[J]. Environmental Science, 2014, 35(5): 1968-1973.
氧化铜纳米颗粒对水稻幼苗根系代谢毒性的研究
王淑玲1, 张玉喜1, 刘汉柱1, 辛华1,2     
1. 青岛农业大学生命科学学院,青岛 266109;
2. 山东省植物生物技术高校重点实验室,青岛 266109
收稿日期：2013-9-22; 修订日期：2013-11-8.
作者简介：王淑玲(1987~),女,硕士研究生,主要研究方向为植物学,E-mail:wangshl0309@163.com
通讯联系人：辛华,hxin@qau.edu.cn
摘要：为阐明氧化铜纳米颗粒（CuO NPs）暴露对植物生长的影响，分别用CuO NPs悬浮液、氧化铜大颗粒（CuO BPs）悬浮液和硫酸铜（CuSO4·5H2 O）溶液进行处理，以蒸馏水（d H2O）作为对照，水培水稻幼苗，研究了CuO NPs对水稻幼苗根系相关生理生化行为的影响. 结果表明，不同处理对水稻幼苗根系的影响有很大差异，经CuO NPs悬浮液处理后，水稻幼根受损较严重，根系活力明显降低，根内丙二醛（MDA）含量和过氧化氢（H2O2）含量显著升高，超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）活性明显增强. 不同处理对水稻幼苗根的影响依次为：CuO NPs>CuSO4·5H2 O>CuO BPs>d H2O. 说明氧化铜纳米颗粒对水稻根的毒害作用不仅是由于释放离子引起的，纳米颗粒本身也起着重要作用，氧化损伤可能是CuO NPs的主要致毒机制之一.
关键词： 氧化铜纳米颗粒     水稻     根     代谢     毒性    
Phytotoxicity of Copper Oxide Nanoparticles to Metabolic Activity in the Roots of Rice
WANG Shu-ling1, ZHANG Yu-xi1, LIU Han-zhu1, XIN Hua1,2     
1. College of Life Sciences, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China;
2. University Key Laboratory of Plant Biotechnology in Shandong Province, Qingdao 266109, China
Abstract: To study the toxicity of copper oxide nanoparticles (CuO NPs) on plant growth, the physiological and biochemical activities of rice (Oryza sativa L.) seedlings were detected under different kinds of treatments (CuO NPs suspension, CuO BPs suspension and CuSO4·5H2 O solution), using distilled water (d H2O) culture as contrast. The results showed that the response of rice roots to four treatments was very different. After treated with CuO NPs suspension, the rice roots were seriously damaged, the root activity obviously decreased, the MDA and H2O2 content rose, and the activity of SOD and POD apparently increased. The effect of different treatments on rice roots followed the order of CuO NPs>CuSO4·5H2 O>CuO BPs>d H2O. The results demonstrated that CuO NPs had a serious effect on the root growth of rice, the toxicity of nanoparticles on rice root was not only caused by the release of Cu ion, the particles also played an important role, and that oxidative damage might be one of the main toxic mechanisms of copper oxide nanoparticles.
Key words: copper oxide nanoparticles     rice     root     metabolism     toxicity    

天然状态下的纳米材料一直存在，矿物风化、 火山爆发等都会产生纳米颗粒，而且生活中的垃圾焚烧、 工业废物和汽车废气排放过程中，也会伴随纳米颗粒的产生[1]. 随着科技的进步，纳米技术迅猛发展，纳米材料在使用过程中不可避免的会流入环境中，其潜在的生态安全问题也引起了人们的广泛关注. 目前，关于纳米材料毒性效应的研究报道已有不少[2, 3, 4, 5]. 多数研究表明，纳米颗粒对生物体具有明显的毒性效应，仅有少数几种纳米材料对生物体没有或有轻微的毒性效应； 纳米颗粒的毒性效应因纳米颗粒的种类和供试材料的不同而异[6,7].

氧化铜纳米颗粒(CuO NPs)由于具有良好的导热、导电、 催化和抗菌性能，被广泛应用于电子、 化工、 机械和农业等领域[8]. 在生物体内，铜作为一种微量元素参与多种代谢活动，而过量的铜离子将会对机体产生毒害作用； 况且，纳米氧化铜由于其独特的性质，比一般氧化铜更活泼，更容易与其他物质发生作用. 因而，纳米氧化铜的毒性效应也引起了人们的注意. 研究发现，较低浓度的纳米氧化铜对白菜(Brassica pekinensis)根和芽的伸长即具有明显的抑制作用[9]. 纳米氧化铜悬浮液培养后的玉米(Zea mays)幼苗叶片明显发黄，须根减少，根伸长被抑制，抑制作用随浓度增加而增强； 而且，CuO NPs还可以被玉米根部吸收，并向地上部运输[10].

目前，CuO NPs的毒性机制尚不清楚. 它们在水中的几种形态对水稻(Oryza sativa)幼根产生的毒性反应鲜见研究报道. 本研究以水稻为实验材料，水培幼苗，分别用CuO NPs悬浮液、 氧化铜大颗粒(CuO BPs)悬浮液和硫酸铜溶液(CuSO4 ·5H2 O)进行处理，以蒸馏水作为对照，通过研究不同处理对水稻根系活力、 水稻根内丙二醛(MDA)含量、 过氧化氢(H2 O2)含量、 超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)活性变化及根部细胞死亡情况的影响，探讨CuO NPs致毒的离子效应和颗粒效应，以期为纳米颗粒的植物毒理机制研究提供进一步的依据.

1 材料与方法 1.1 颗粒特征和CuSO4 ·5H2 O溶液浓度的确定

CuO NPs和CuO BPs均购自美国Sigma-Aldrich公司，CuO NPS纯度≥99.5%，平均粒径小于50nm. CuO BPs纯度为99.99%，取部分颗粒经过喷镀后，在日本电子JSM-7500F扫描电子显微镜下观察粒径大小在0.8~2.5 μm之间. 分别配制浓度为5mg ·L-1，超声30 min后，备用.

将5 mg ·L-1 的CuO NPs悬浮液，分别静置6、 12、 24、 48 h后，取上层清液10 000 r ·min-1离心30 min，用0.22 μm混合纤维滤膜抽滤，滤液用石墨炉原子吸收测定其中的Cu2+浓度，Cu2+浓度于24 h后基本趋于稳定，浓度为0.07 mg ·L-1，据此配制0.27 mg ·L-1的CuSO4 ·5H2 O溶液作为离子对照.

1.2 种子萌发与处理

“中花11号”水稻种子由上海水稻研究所提供. 将水稻种子(40 g/份)充分浸泡，待其吸水饱胀后，用3%的次氯酸钠消毒20 min，蒸馏水清洗3遍后铺在带有小孔的塑料筐底，置于28℃ 恒温培养箱中催芽，种子萌发后移入光照培养箱中继续培养(28℃/16 h光照、 20℃/8 h黑暗). 待根生长至3~4 cm长时，分别用5 mg ·L-1的CuO NPs、 5 mg ·L-1的CuO BPs及0.27 mg ·L-1的CuSO4 ·5H2 O溶液处理，蒸馏水作对照. 分别取处理6、 12和24 h后的水稻根测定各种生理指标.

1.3 各种代谢活动的研究

水稻根系活力的形态观察：取不同处理的水稻根尖，分别用氯化苯基四氮唑(TTC)和埃文斯蓝(Evans blue)染色后，在JM Olympus体视显微镜下观察并拍照.

水稻根系各种代谢活动的测定：水稻根系活力的测定采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法[11]； H2 O2含量的测定采用比色法[12]； MDA含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)反应法[13]； SOD活性的测定采用氮蓝四唑(NBT)光还原法[14]； POD活性的测定参照Cakmak等[15]的方法. 每个测定设3个重复.

实验数据统计分析采用SPSS 15.0软件，用ANOVA(analysis of variance,LSD检验法)进行方差分析.

2 结果与分析 2.1 不同处理对水稻幼苗根系活力的影响

水稻的根经过TTC染色后，可以看出，处理6 h时，CuO NPs、 CuO BPs和CuSO4 ·5H2 O处理的水稻根尖染色程度与对照相似，均呈红色，没有很明显的差别[图 1(a)]； 12 h后，CuO NPs和CuSO4 ·5H2 O处理的水稻幼根染色变暗，特别是根冠区，几乎变为灰色[图 1(b)]，CuO BPs处理的根颜色没有很大变化，更红一些，分析可能是释放的少量铜离子短时间内有利于提高根的活性； 24 h后，CuO NPs处理的根尖除分生区外其他几乎变为灰色，CuO BPs处理的根尖根冠区也变为灰色[图 1(c)].

图 1 水稻根系活力的形态观察 Fig. 1 Morphological observation of rice root activity (a)处理6 h的水稻根，(b)处理12 h的水稻根，(c)处理24 h的水稻根 每幅图中从左到右依次为dH2 O、 CuO BPs、 Cu2+和CuO NPs处理的水稻根

根系细胞受损伤程度的大小与根系活力有着密切的关系，因此，细胞活力的大小能够从侧面反映根系活力的大小. Evans blue能够通过损伤后的细胞膜，与胞内蛋白质结合形成蛋白质和Evans blue的复合物从而被染上蓝色. 不同处理后，细胞死亡情况的动态检测结果如图 2所示. 处理6 h时，CuO BPs和CuSO4 ·5H2 O处理的水稻根尖染色程度与对照相似，除了分生区外侧将要脱落的根冠细胞稍微呈现蓝色外，其它部位几乎不显色，而CuO NPs处理的水稻根着色较重[图 2(a)]； 12 h时，各种处理的根着色较6 h时都有所增加，这可能是由于根系新陈代谢、 细胞脱落死亡引起的，但是不同处理的着色程度并不相同，CuO BPs处理与对照相比无明显差别，但CuSO4 ·5H2 O和CuO NPs处理的根着色都较对照深，而且分生区顶端的根冠细胞也开始着色[图 2(b)]； 24 h时，CuSO4 ·5H2 O和CuO NPs处理的根着色进一步加深[图 2(c)].

图 2 水稻根尖细胞死亡动态检测 Fig. 2 Dynamic detection of dead cells in root tips of rice (a)处理6 h的水稻根,(b)处理12 h的水稻根,(c)处理24 h的水稻根; 每幅图中从左到右依次为dH2 O、 CuO BPs、 Cu2+和CuO NPs处理的水稻根

不同处理的水稻幼苗根系活力随时间的变化如图 3所示. 从中可以看出，随着处理时间的延长，CuO BPs处理的水稻根系活力与蒸馏水处理的几乎没有很大区别，CuSO4 ·5H2 O处理的根活力明显下降，而CuO NPs处理的水稻根系活力急剧下降，这与上面水稻根系活力形态观察的结果基本一致.

图 3 不同处理水稻幼根根系活力随时间的变化 Fig. 3 Time-dependent change of rice root activity with different treatments
2.2 不同处理对水稻幼根H2 O2含量的影响

正常生长条件下，植物体内H2 O2的产生和清除过程基本保持一种精细的平衡状态，这样既保证了植物体内H2 O2具有一定的生理功能，同时也将其对植物的伤害效应降到最低. 从图 4可以看出，24 h内，蒸馏水培养的水稻根中几乎检测不到H2 O2. 但是，其他3种处理的根均可检测到. 处理6 h后，CuO NPs、 CuO BPs和CuSO4 ·5H2 O处理的水稻幼苗根尖内H2 O2含量已有明显增多，随着处理时间的延长，CuO NPs、 CuO BPs和CuSO4 ·5H2 O处理的水稻幼苗根尖内H2 O2含量较对照持续增多，其增加量由大到小依次为：CuO NPs>CuSO4 ·5H2 O>CuO BPs>dH2 O. H2 O2含量增加说明可能引起了水稻幼根内活性氧代谢的波动和紊乱.

图 4 不同处理水稻幼根内H2 O2含量随时间的变化 Fig. 4 Time-dependent change of H2 O2 content in rice roots with different treatments
2.3 不同处理对水稻幼苗根系MDA含量的影响

不同处理对水稻幼苗根尖MDA含量的影响如图 5所示. MDA是膜脂过氧化作用的最终分解产物，其含量的多少反映了植物遭受逆境伤害的程度. 从图 5可以看出，6 h后，CuO BPs 处理的水稻幼苗根尖内MDA含量较对照有稍微增加，CuO NPs和CuSO4 ·5H2 O处理的根尖内MDA含量较对照已显著增加； 12 h后，CuO NPs处理的根内MDA含量进一步增多，较CuSO4 ·5H2 O处理的有明显增多，而CuO BPs处理的根内MDA含量无明显变化； 处理24 h后，CuO BPs、 CuSO4 ·5H2 O和CuO NPs处理的根内MDA含量分别为对照的114%、 220%和255%. 不同处理水稻幼苗根尖内MDA含量的差别说明根部细胞发生膜脂过氧化反应、 受损伤的程度不同.

图 5 不同处理水稻幼根内MDA含量随时间的变化 Fig. 5 Time-dependent change of MDA content in rice roots with different treatments
2.4 不同处理对水稻根内SOD和POD活性的影响

不同处理水稻幼苗根尖内SOD活性随时间变化的结果如图 6所示. 从中可以看出，6 h后，CuSO4 ·5H2 O和CuO BPs处理的水稻幼苗根尖内SOD活性较对照的变化并不明显，而CuO NPs处理的根内SOD活性即已显著升高； 12 h后，CuO NPs和CuSO4 ·5H2 O处理的根内SOD的活性较对照进一步升高； 24 h后，CuO BPs处理的水稻幼苗根尖内SOD活性未发生明显变化，而CuSO4 ·5H2 O和CuO NPs处理的根尖内SOD活性再次升高，分别为对照的1.36倍和1.42倍.

图 6 不同处理水稻幼根内SOD活性随时间的变化 Fig. 6 Time-dependent change of SOD activity in rice roots with different treatments

POD作为生物体内的活性氧清除剂之一，与SOD等相互配合组成生物体的防氧化链条，消除体内的自由基，帮助植物抵抗氧化损伤，在保护机体免受氧化损伤方面发挥重要作用. 从图 7可以看出，不同处理的POD活性与SOD活性变化趋势基本一致.

图 7 不同处理水稻幼根内POD活性随时间的变化 Fig. 7 Time-dependent change of POD activity in rice roots with different treatments
3 讨论

纳米材料的植物毒性不单是由于溶解的重金属离子引起的，毒性与颗粒自身大小、 形态、 表面活性和溶解性等因素有很大关系[16,17]. CuO NPs在水溶液中会团聚成大颗粒，也会释放出Cu2+，因此，在研究CuO NPs的毒性效应时，既利用CuO BPs进行处理，也测定了相应浓度的Cu2+进行处理. Cu2+是植物生长必需的微量元素之一，在植物体生长发育及新陈代谢过程中发挥着重要作用，但如果浓度大于植物生长所需的浓度界限时，则会产生重金属毒害作用. 通过TTC法和Evans blue染色结果表明，CuO NPs对水稻幼苗的毒性作用均大于Cu2+和CuO BPs，而且，这种方法的结果与根系活力定量测定的结果一致. 根系活力是反映根系代谢强度大小的重要指标，活力越高，说明根系组织的代谢活动越旺盛. 因此，该种染色方法可以作为定性测定植物根系活力和细胞受损伤程度的快速方法.

根系活力测定结果表明，CuO NPs、 Cu2+和CuO BPs处理的水稻幼苗根系活力均有一定程度的降低，24 h后，不同处理对根系活力抑制程度的大小依次为：CuO NPs>Cu2+>CuO BPs>dH2 O. 根内的H2 O2含量及MDA含量、 POD和SOD活性变化的测定也得出了同样的结果. 不同形态的重金属铜对水稻幼根的影响程度由大到小依次为：CuO NPs>Cu2+>CuO BPs>dH2 O. 这与前人关于不同形态重金属铜对白菜幼苗根伸长的影响的结果不大一致[9]，这可能是由于不同种类的植物材料对纳米颗粒的反应不同引起的. 由于纳米氧化铜具有较大的比表面积，较氧化铜大颗粒更容易与周围的小分子发生反应，在溶液中释放离子的速度较大颗粒更快[18]，这可能是纳米氧化铜毒性效应较大颗粒显著的原因之一. 本实验结果也支持该观点.

目前，已有许多关于纳米颗粒致毒机制的研究，大部分研究提出，氧化损伤可能是纳米颗粒主要的致毒之一. 金盛杨等[19]研究了纳米氧化铜对小麦(Triticum aestivum)根系SOD活性、 MDA含量和根系活力的影响，结果表明，在一定浓度范围内，这3种指标随纳米氧化铜浓度增加出现先升高后降低的趋势； 王震宇等[20]的研究结果表明，人工合成纳米TiO2 和MWCNTs对玉米幼苗的抗氧化系统均具有较大影响； Sayes等[21] 认为，纳米C60主要是通过诱导细胞脂质过氧化而产生毒性的. 由于纳米材料独特的性能，其表面晶格更易遭破坏，产生更多活性位点，与植物细胞点接触会增加体内的过氧化反应，导致体内自由基含量的增加. 有研究表明，少量的CuO NPs进入细胞即能诱导细胞产生大量的活性氧[22]，而溶酶体和线粒体等细胞器参与了活性氧的产生[23,24]. Wang等[25]在完整的微囊藻(Microcystis aeruginosa)内检测到了纳米颗粒的存在，并且与富里酸结合的纳米氧化铜能够诱导微囊藻产生更多的活性氧. 本实验中，纳米颗粒处理的水稻幼根中MDA和H2 O2含量较其他处理显著增多，同时，该处理组中SOD和POD的活性均高于其他处理，说明纳米颗粒处理刺激水稻幼根内产生了更多的活性氧，这可能是由于纳米氧化铜已经进入到了水稻根尖细胞内，但是具体的进入和积累途径有待于进一步研究.

4 结论

(1)CuO NPs对水稻幼根具有明显的毒性，导致其根系活力下降，根部细胞大量死亡. 水稻根中H2 O2和MDA的含量显著增高，SOD 和POD的活性明显增强，说明CuO NPs可能进入根内，并对细胞造成了伤害.

(2)CuO NPs对水稻幼根的影响明显大于CuO BPs和Cu2+处理，说明，纳米氧化铜的毒性效应不单是由溶解的Cu2+引起的，纳米颗粒本身也起了很大的作用.

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