铜(Cu)在自然界中广泛分布. 近年来随着工农业的发展，采矿、 石油冶炼、 农药施用等人为活动使得越来越多的Cu进入到环境中，造成环境污染. 通常Cu污染水体的浓度在30~60 μg ·L^-1[1]，而一些工业排放污水可以达到1000 mg ·L^-1. 应用大型水生植物，如挺水植物、 浮叶植物和漂浮植物修复水体重金属污染已经得到广泛研究^{[2, 3, 4, 5, 6, 7, 8]}. 沉水植物作为水体生态系统中具有重要生态和环境功能的初级生产者，具有很强的修复重金属污染水体的潜力^[9,10]，然而沉水植物对Cu的吸收和富集机制尚不明确，阻碍了其应用于水体Cu污染修复.

本研究选取了自然水体中常见的两种沉水植物轮叶黑藻和穗花狐尾藻为对象. 这两种植物在水体中分布于不同深度区域且具有明显不同的形态和生理特征，但它们在世界范围内均广泛分布，都具有很强的繁殖能力和较大的生物量，而且已有研究表明这两种植物均具有很强的富集水体中重金属的能力，如Pb、 Hg、 Cd、 Ni、 As和Cu，因此是理想的水体修复材料^{[9, 11, 12, 13, 14, 15]}. 笔者研究了轮叶黑藻和穗花狐尾藻对Cu的短期吸收动力学及不同亚细胞组分对铜的吸收动力学特征，探讨两种沉水植物对Cu的吸收与富集机制，同时通过Cu释放研究进一步明确沉水植物对Cu的代谢过程，以期为沉水植物应用于水体Cu污染提供重要的理论依据. 1 材料与方法 1.1 植物材料与培养

轮叶黑藻[Hydrilla verticillata (L. f.) Royle]和穗花狐尾藻(Myriophyllum spicatum L. )取自江苏省无锡市太湖水域. 植物采集后置于温室的玻璃缸内(50 L，含5~10 cm土层和1 cm石英砂，取10~20 cm植物顶枝栽于土中，待其生出新根和顶枝)培育3~5个月. 对植物进行处理之前，取生长一致的顶枝于人工淡水中驯化7 d.

人工淡水配方：22.7 mg ·L^-1 MgSO₄ ·7H₂ O,30.7 mg ·L^-1 MgCl₂ ·2H₂ O,20.4 mg ·L^-1 CaCl₂ ·2H₂ O,45.7 mg ·L^-1 NaCl,26.0 mg ·L^-1 NaHCO₃,3.61 mg ·L^-1 KCl,1.41 mg ·L^-1 FeCl₃ ·6H₂ O,0.97 mg ·L^-1 Al₂(SO₄)₃ ·18H₂ O,0.19 mg ·L^-1 MnCl₂ ·4H₂ O,3.86 μg ·L^-1 ZnSO₄ ·7H₂ O,2.17 μg ·L^-1 CuCl₂ ·2H₂ O^[16]，溶液pH值用NaOH和HCl调至7.0，此pH值条件下，溶液中Cu主要以Cu²⁺形式存在^[17].

植物生长条件：试验在可控光控温的培养箱中进行，光暗周期为14 h/10 h，25℃±2℃，光照强度为115 μmol ·(m² ·s)^-1，相对湿度70%. 1.2 铜的短期吸收动力学研究

植物驯化7 d后，挑选生长一致的、 健康的顶枝进行吸收动力学试验. 试验前用双蒸水清洗植物并拭干. 称取0.3 g植物放入一系列盛有50 mL Cu溶液(CuCl₂)的具塞三角瓶中，浓度分别为0、 5、 20、 40、 80、 160、 320、 460和640 μmol ·L^-1. 每个处理3个重复. 所有的待测液中均含有5.0 mmol ·L^-1的MES(2-N-吗啉代乙磺酸)和0.5 mmol ·L^-1 CaCl₂以保持体系的pH值(6.0)和离子强度. 三角瓶置于60 r ·min^-1的摇床上振荡20 min，温度25℃. 将植物取出后，于EDTA混合溶液(5 mmol ·L^-1 EDTA+5 mmol ·L^-1 MES，pH 6.0)中浸提5 min去除吸附在植物表面的Cu，之后用去离子水冲洗3次并拭干，于70℃烘箱烘干至恒重，消煮测定植物体内Cu含量. 通常米氏方程(Michaelis-Menten Equation)用作表征酶促反应动力学，在此通过拟合米氏方程表示植物对金属的吸收动力学特征：

为了探讨两种沉水植物对Cu的吸收和富集过程，于不同时间处理下，测定茎、 叶内各亚细胞组分的Cu含量. 将挑选好的生长一致的植物顶枝(每盆6株)，置于200 mL的2 μmol ·L^-1 Cu溶液中(毒理试验研究表明，在保证两种沉水植物正常生长前提下，在此Cu溶液浓度下对Cu的富集能力最强)，分别处理0、 2、 5、 12、 24和96 h. 每个处理3个重复. 取样后将植物用去离子水冲洗干净并拭干，分为茎、 叶两部分，于液氮中保存，进行亚细胞分离测定. 1.4 植物亚细胞分离提取

采用差速离心法分离不同的亚细胞组分. 在经典方法基础上加以改进：称取植物鲜样0.5 g，加入预先冷藏的提取液[500 mmol ·L^-1蔗糖+50 mmol ·L^-1 Hepes磷酸缓冲液(pH 7.5)+1 mmol ·L^-1二硫赤鲜糖醇(DTT)+5.0 mmol ·L^-1抗坏血酸+质量浓度10 g ·L^-1交联聚酰酮(PVPP)]，研磨匀浆. 第一步：匀浆液经过100 μm孔径的尼龙网过滤，并用提取液冲洗，保证最终加入的提取液共计8 mL； 第二步：将上清液在冷冻离心机500 r ·min^-1(Hettich Universal 320R，Sigma，美国)下离心15 min，得到的沉淀加上第一步过滤的沉淀为细胞壁组分； 第三步：上一步得到的上清液在10000 r ·min^-1下高速离心30 min (Hitachi CR22GⅡ，日本)，得到的沉淀为细胞器组分，上清液为可溶部分. 全部操作在4℃下进行. 细胞壁和细胞器组分别于70℃烘干消煮测定Cu含量； 可溶部分加入40 μL优级纯浓硝酸于4℃保存待测溶液中Cu浓度. 1.5 铜的释放研究

将挑选好的轮叶黑藻和穗花狐尾藻(0.7 g左右)分别置于2 μmol ·L^-1 Cu溶液中培养24 h，之后洗去吸附在植物表面的Cu，去离子水洗净拭干，置于50 mL超纯水中，分别于0、 20 min、 2 h、 12 h和24 h取样，测定溶液中的Cu浓度.

此外还以轮叶黑藻为例，研究了代谢抑制剂间氯苯腙羰基氢化物(CCCP)和2,4-二硝基苯酚(DNP)以及P-型ATP酶抑制剂钒酸钠对Cu释放的影响. 如上所述将处理好的植物置于50 mL不同处理的溶液中. 处理包括：对照(超纯水)，+1 μmol ·L^-1 CCCP，+200 μmol ·L^-1钒酸钠(Vanadate)，+200 μmol ·L^-1 DNP. 每个处理重复3次. 处理2 h后测定溶液中Cu浓度. 1.6 样品消煮和分析

将烘干的植物样品剪碎称取0.02 g，置于50 mL聚丙烯酰胺管中，加入5mL优级纯浓硝酸过夜，于CEM微波消解炉进行微波消煮(MARS； CEM Microwave Technology Ltd,U. S. ). 消煮过程中温度缓慢上升，第一阶段55℃ 加热10 min，第二阶段75℃ 加热10 min，第三阶段95℃ 加热30 min至酸解液澄清透明，植物样完全分解. 同时加入试剂空白和标准物质(灌木枝叶，GBW07602，国家标准物质研究中心)作为消煮过程和测定分析的质量控制. 待消煮液冷却后用超纯水(18.2 MΩ)定容至25 mL，过滤. 采用原子吸收光谱仪(AASM6，Thermo Elemental,美国)测定消煮液中的Cu浓度. 试验测得标准物质(灌木枝叶，GBW07602)的平均Cu浓度(以DW计，下同)为(5.2±0.5) mg ·kg^-1，该值在标准物质的参考阈值范围内[(4.9±0.3) mg ·kg^-1]，说明该消解方法可靠. 1.7 数据分析

试验数据采用SPSS 13.0进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，用最小显著差数法(LSD法)进行数据的多重比较. 采用SigmaPlot 10.0软件作图. 2 结果与分析 2.1 铜的短期吸收动力学特征

铜的短期动力学试验中，较低浓度Cu处理时(0~160 μmol ·L^-1)，随着外界Cu浓度的增加，轮叶黑藻和穗花狐尾藻对Cu的吸收速率均呈线性增加(图 1). 穗花狐尾藻对Cu的吸收直线斜率约为黑藻的2倍(表 1).

较高浓度Cu处理时(0~640 μmol ·L^-1)，随着外界Cu浓度的增加，轮叶黑藻和穗花狐尾藻对Cu的吸收速率均呈曲线增加，并且其吸收动力学曲线可以很好地拟合米氏方程，相关系数R2分别可达0.978和0.980 (表 1). 两种植物的最大吸收速率差异不显著(P>0.05)，但是轮叶黑藻的米氏常数Km约为穗花狐尾藻的2倍.

图 1

Fig. 1

图 1 轮叶黑藻和穗花狐尾藻对Cu的短期吸收动力学特征 (mean±S.E.,n=3) Fig. 1 Uptake kinetics of Cu by H. verticillata and M. spicatum

表 1(Table 1)

表 1 轮叶黑藻和穗花狐尾藻吸收Cu的动力学参数 1) Table 1 Kinetic parameters for Cu influx into H. verticillata and M. spicatum 沉水植物 线性方程 米氏方程 A(斜率) b(截距) R2 Vmax/μmol·(g·min)-1 Km/μmol·L-1 R2 轮叶黑藻 0.005 0.010 0.999 2.17±0.25 250±67.2 0.978 穗花狐尾藻 0.009 0.054 0.991 2.49±0.19 146±31.8 0.980 1)较低浓度Cu处理时(0~160 μmol ·L-1)，吸收曲线用线性回归方程拟合； 较高浓度Cu处理时(0~640 μmol ·L-1)，吸收曲线用米氏方程拟合

表 1 轮叶黑藻和穗花狐尾藻吸收Cu的动力学参数 1) Table 1 Kinetic parameters for Cu influx into H. verticillata and M. spicatum

植物体中各亚细胞组分的Cu含量用鲜重(FW)计算(图 2). 96 h处理内， 轮叶黑藻叶片中富集的Cu主要分布在细胞壁(79%~85%)，其次是可溶部分(12%~17%)和细胞器(3%~8%)； 暴露于2 μmol ·L^-1 Cu溶液2 h后，叶片各组分Cu含量均迅速增加，约为对照的2倍； 之后随处理时间的增加各组分Cu含量缓慢增加并约在12 h后达到平衡，但是细胞壁组分增加的Cu含量显著高于细胞内组分； 96 h处理各组分Cu含量略降低[图 2(a)]. 轮叶黑藻茎中富集的Cu总含量(各亚细胞组分Cu含量之和)显著低于叶片(P<0.05)，各亚细胞组分Cu的分布顺序为：细胞壁(35%~46%)=可溶部分(35%~51%)>细胞器(8%~23%)； 随处理时间的增加，各亚细胞组分Cu含量均逐渐增加，约在12 h达到平衡，96 h处理略有降低[图 2(c)].

图 2

Fig. 2

图 2 2 μmol ·L-1 Cu处理96 h内两种植物叶片和茎中Cu亚细胞分布 (mean±S.D.,n=3) Fig. 2 Subcellular distributions of Cu by leaves and stems of H. verticillata and M. spicatum exposed to 2 μmol ·L-1 Cu for different times up to 96 h

96 h处理内，穗花狐尾藻叶片中富集的Cu同样主要分布在细胞壁(60%~64%)，但是其对Cu的富集量显著低于黑藻(P<0.05)，其次分布在可溶部分(17%~24%)和细胞器(5%~8%)，两种植物细胞内组分Cu富集含量差异不显著(P>0.05)； 各亚细胞组分Cu含量随时间呈现出与轮叶黑藻相似的变化趋势，2 h后各组分含量迅速增加为对照的2~3倍，之后缓慢增加并于12 h达到平衡并保持稳定[图 2(b)]. 穗花狐尾藻茎中富集的总Cu含量同样显著低于叶片，且低于轮叶黑藻对Cu的富集量； 各亚细胞组分Cu分布顺序为：细胞壁(35%~50%)=可溶部分(20%~51%)>细胞器(6%~18%)； 茎中各亚细胞组分Cu含量随时间的变化规律与叶片相同[图 2(d)]. 2.3 沉水植物对铜的释放能力

轮叶黑藻和穗花狐尾藻在2 μmol ·L^-1 Cu溶液中暴露24 h后，置于不含Cu的溶液中进行Cu释放研究. 结果如图 3所示，随时间延长，两种植物释放到溶液中的Cu含量均呈曲线增加. 其中轮叶黑藻Cu释放能力显著高于穗花狐尾藻(P<0.05)，20 min后轮叶黑藻释放到溶液中Cu含量达到0.4 μmol ·L^-1，是穗花狐尾藻释放量的近10倍； 24 h后轮叶黑藻和穗花狐尾藻释放的Cu含量达到最大值，分别为0.9 μmol ·L^-1和0.2 μmol ·L^-1. 但是两种植物对Cu的释放量仅约为Cu的富集量的1/16(数据未列出).

图 3

Fig. 3

图 3 轮叶黑藻和穗花狐尾藻在24 h内Cu的释放量 Fig. 3 Cumulative efflux of Cu by H. verticillata and M. spicatum during 24 h time course

轮叶黑藻于2 μmol ·L^-1 Cu溶液中处理24 h后，置于不含Cu的不同处理溶液中，用植物鲜重计算植物向外释放的Cu含量(以FW计，mg ·kg^-1 )(图 4). 与对照相比，CCCP处理Cu的释放量增加了40%，而DNP显著抑制了Cu的释放(P<0.05)，降低了30%，钒酸钠(vanadate)不影响轮叶黑藻对Cu的释放.

图 4

Fig. 4

图 4 不同抑制剂对黑藻Cu释放的影响 Fig. 4 Effects of CCCP,DNP and sodium vanadate on the efflux of Cu 不同字母表示处理间差异显著， P<0.05; S.E.(n=3)

短期吸收动力学研究表明，较低浓度Cu处理时(0~160 μmol ·L^-1)，两种植物可以迅速吸收外界的 Cu，吸收速率呈线性增加，说明Cu可能是以被动扩散方式进入植物体内的^[18]. 早期有研究发现在厌氧条件和代谢抑制剂存在时，植物对Cu的吸收不受影响，表明Cu吸收不受代谢调节^[19]； 而较高浓度Cu处理时，两种植物对Cu的吸收动力学曲线符合米氏方程(表 1)，可见Cu的吸收并非完全是被动扩散过程，而是同时以主动和被动方式进入轮叶黑藻和穗花狐尾藻细胞内的. 并且各亚细胞组分吸收动力学试验表明，两种植物叶片和茎中的Cu含量均在约12 h后达到平衡(图 2)，说明Cu由溶液进入植物细胞壁再进入细胞内部是一个快速的过程. 尽管两种植物的最大吸收速率差异不显著，但在2 μmol ·L^-1 Cu溶液中暴露不同时间后，轮叶黑藻叶片和茎中Cu富集含量均显著高于穗花狐尾藻(图 2)，这与颜昌宙等^[15]的研究结果一致，可见植物对Cu的富集能力不仅与吸收速率有关，还受体内富集和代谢的影响.

各亚细胞组分对Cu的吸收动力学研究表明，轮叶黑藻叶片各亚细胞组分中只有细胞壁的Cu含量显著高于狐尾藻，这可能与两种植物的化学组成有关. 轮叶黑藻体内的粗纤维素占干物质的比重是穗花狐尾藻的2倍多，因此细胞壁表面可以提供更多的Cu吸附位点，导致富集量较高^[15]. 而且随时间增加，两种植物叶片中增加的Cu含量均主要富集在细胞壁(图 2)，可见将Cu富集在细胞壁是这两种沉水植物对Cu的主要抗性机制之一，这与Fritioff等^[20]对眼子菜富集Cu的研究结果一致. 并且两种植物叶片对Cu的富集能力均高于茎，这与其他人对沉水植物的研究结果一致^[20,21]. 首先是由于叶片与溶液的接触面积高于茎，其次可能是叶片表面可以提供更多的阳离子吸附位点. Fritioff等^[20]对眼子菜的研究表明，叶片的有机质含量高于茎，有机质组分包含大量细胞壁胶质，其中含有很多带负电荷的聚半乳糖醛酸，可以提供大量的阳离子结合位点.

Cu的释放试验结果表明，两种植物均可将体内富集的Cu释放到外界环境中，且释放到水体的Cu含量随时间增加呈曲线增加(图 3)，同时代谢抑制剂DNP的加入抑制了对Cu的释放(图 4)，说明这是一个依靠能量的主动过程，但是钒酸钠不影响Cu的释放，说明这不依靠P型ATP酶的作用，因此水稻体内鉴定到的负责向外运输Cu的P型-ATP酶家族基因OsHMA9^[22]不是轮叶黑藻体内负责向外释放Cu的作用基因. CCCP促进Cu的释放，可能是因为CCCP作为一种解耦联剂，会引起质膜的去极化，从而增加Cu离子释放^[23]. 主动释放体内富集的重金属是细菌主要的抗性机制，参与的转运子包括P-型ATP酶或者阳离子/H⁺反向运载器等^[24]. 虽然还不清楚哪些转运蛋白参与Cu离子的释放过程，但是至少证明这两种沉水植物具有主动释放Cu的能力. 而且轮叶黑藻释放Cu的能力较强，同时短期动力学结果也表明，轮叶黑藻的米氏常数Km高于穗花狐尾藻(表 1)，说明轮叶黑藻细胞质膜对Cu的结合能力较弱. 但是它们对Cu的释放能力均远低于Cu的富集能力，不影响对Cu的修复作用.

两种沉水植物相比，相对于穗花狐尾藻，轮叶黑藻属于“抵抗植物”，通过将Cu富集在细胞壁而阻止向细胞内运输，此外还可以通过释放体内富集的Cu来降低毒害作用，这也是Cu抗性植物(如白玉草，Silene vulgaris)的主要抗性机制^[25]； 而穗花狐尾藻细胞内组分Cu富集量与轮叶黑藻相同，且具有较低的Cu释放能力，因此它可能具有较强的体内抗氧化能力. 颜昌宙等^[15]对比分析了轮叶黑藻和穗花狐尾藻体内叶绿素、 SOD等抗氧化酶类含量在不同浓度Cu暴露下的变化，结果表明穗花狐尾藻具有较强的内部抗氧化能力，与本试验结论相符.

总之，这两种沉水植物对Cu均具有较强的吸收和富集能力，并且两种沉水植物均具有较大的生物量以及较强的繁殖能力，尽管可以向体外释放Cu，但释放能力远小于吸收能力，因此具有应用于修复Cu污染水体的潜力. 4 结论

(1)轮叶黑藻和穗花狐尾藻均具有快速的Cu吸收能力. 在2μmol ·L^-1Cu溶液中暴露不同时间(0~96 h)后，两种沉水植物叶片和茎中各亚细胞组分中的Cu含量均迅速增加，并约在12 h后达到平衡. 随处理时间增加，两种植物叶片中增加的Cu含量均主要分布在细胞壁(占各亚细胞总量的>60%)； 茎对Cu的富集能力均低于叶片，各亚细胞Cu的分布顺序为：细胞壁=可溶部分>细胞器.

(2) 两种沉水植物相比，轮叶黑藻叶片和茎富集的Cu含量均显著高于穗花狐尾藻，并且叶片细胞壁富集的Cu含量显著高于穗花狐尾藻，而细胞内部富集的 Cu含量差异不显著； 轮叶黑藻体内释放Cu的能力也高于狐尾藻，并且是主动释放Cu的过程.