2014, Vol. 35
2. 中国科学院大学,北京 100049;
3. 集美大学水产学院,厦门 361021
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Fisheries College, Jimei University, Xiamen 361021, China
水是人们赖以生存的珍贵资源，同时也是微生物或病原菌的传播载体. 水体中的病原菌主要来自于人畜粪便、 垃圾、 医疗污水、 生活污水以及工业废水等[1]. 病原菌随着污水排放进入自然水体中，其中大量病原体能够长期存活，对水生生物及人类健康产生潜在的危险，从而引发水域生态环境质量问题. 时至今日，水环境污染及水传播造成的病原体感染依旧是备受关注的全球性环境污染问题之一[2,3]. 因此，水域病原菌污染一直是环境污染防治的重要议题. 虽然，现有污水处理设施可去除污水中含有的部分病原菌，但仍有相当数量的病原菌被排放到自然水体[4, 5, 6]. 而污水厂二级出水未经过深度处理直接回用于城市绿化和道路冲洗或降尘，也会导致病原体的污染和传播，对公众健康产生潜在威胁[7]. 此外，由于我国国情限制，乡镇农村的污水处理设施建设尚未全面完成，水域生态环境监测和污染防治工作形势严峻. 当前，我国水域病原菌污染状况调查工作也相对较少，还未把健康风险评价列入常规环境评价工作中[8, 9, 10]，水环境病原体污染风险评价方面的研究已成为当下的热点课题之一.
早期的病原菌鉴定和检测主要借助显微镜和分离培养技术，然而由于这些方法自身的局限性和偏好性，极大的限制了人们对环境微生物包括病原菌的认识[1]. 因此，开发快速、 准确的病原菌检测手段，防治病原菌污染传播，是保障生态环境健康和公共卫生安全的重要基础. 近20年来，分子生物学技术的应用，如聚合酶链式反应(PCR)、 克隆文库(clone library)、 定量PCR(quantitive PCR,qPCR)和微点阵列(microarray)等，极大促进了人们对环境病原菌污染的认知[1,4]. 然而这些“传统”分子生物学技术仅揭开了冰山一角——它们只能分析环境中分布的优势菌群(dominant species，相对丰度高于总生物量的1%)[11]. 近年来，高通量测序技术(high-throughout sequencing)的应用为人们进一步深入认识环境中的微生物提供了重要契机[1, 11, 12, 13]. 与以往的分子生物学技术相比，高通量测序技术可获得海量数据，偏好性和单位运行成本较低，并且理论上可检测出环境中所有的微生物. 目前，多位学者应用该技术成功检出了空气、 活性污泥、 人体以及医院中分布的病原菌[14, 15, 16, 17]. 相对于以往检测病原菌常用的qPCR和microarray技术，高通量测序技术的优势在于不仅能够提供具体的序列信息，还可同时检测多种病原菌，并具有检测、 发现新型病原菌的潜力. 然而此项技术尚未在国内应用，且当前文献中的病原菌数据库尚不全面.
九龙江是福建省的第二大河流，主要由西溪、 北溪两大支流组成，流域面积14000 km2，是龙岩、 漳州和厦门三市的主要饮用水源地[12](Figure 1">图 1). 由于人类活动和城市化进程影响，九龙江水质富营养化程度加剧，生态环境问题日益严峻[18, 19, 20]. 一方面陆源性污染可能会促进潜在病原菌的传播和繁殖[21,22]，另一方面也会导致抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)的大量输入[22,23]. 但当前九龙江流域的微生物相关研究还较为缺乏. 本文应用16S rRNA基因-454焦磷酸测序技术，对北溪、 西溪的浮游和底栖细菌群落开展研究，测定细菌16S rRNA基因V1~V3高变区序列，并与病原菌参考数据库对比分析，获得了九龙江流域潜在病原菌污染状况的初步数据. 考虑到营养盐的浓度高低及形态组成可在一定程度上反映九龙江地区的人类活动强度与类型[18, 19, 20]，因此进一步分析了病原菌丰度与营养盐浓度之间的潜在相关关系，以期为后续九龙江流域的病原微生物污染来源及公共安全风险评估提供资料.
 | Figure 1">图 1 九龙江采样站位示意Figure 1">Fig. 1 Location of sampling stations in Jiulong River |
2011年10月，于九龙江(Jiulong River,JR)两大支流西溪(West River,WR)和北溪(North River,NR)采集样品[12].图 1展示了采样点的地理位置(北溪和西溪各设置9个采样点)，共采集了17个表层水体样品和18个沉积物样品(NR_8站位水样瓶在搬运过程中破裂，因此未进行后续的分子生物学分析). 水样用0.22 μm聚碳酸酯滤膜(Millipore公司)过滤收集浮游细菌； 沉积物置于50 mL无菌离心管. 样品带回实验室后置于-80℃冰箱保存. 同时，采集水样用于测定营养盐(NH+4-N、 NO-2-N、 NO-3-N和SRP).
1.2 环境参数测定表层水体的温度、 电导、 pH和DO用WTW水质分析仪(WTW公司)现场测定. 用于测定营养盐的水样经0.45 μm醋酸纤维滤膜过滤后，用AA3 Auto-Analyzer营养盐自动分析仪(Bran+Luebbe Co.,德国)测定. 环境参数的测定方法和数据参见文献[12].
1.3 DNA提取、 16S rRNA基因片段PCR扩增和454焦磷酸测序水样DNA提取方法修改自文献[24]. 沉积物DNA用FastDNA Spin kit for Soil试剂盒(MP Biomedicals公司)提取. DNA片段大小和质量用0.8%的琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop分光光度计(Thermo Fisher公司)测定.
细菌16S rRNA基因V1~V3高变区用27F/534R引物对扩增，27F引物5′端带有10 bp的序列标签用于样品区分[12]. PCR反应程序如下：94℃预变性5 min； 94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共25个循环； 最终72℃延伸7 min. PCR产物用胶纯化试剂盒(Qiagen公司)纯化. 回收产物浓度用Qubit dsDNA BR Assay Kit(Life Technologies公司)进行精确定量并等量混合，送至深圳华大基因科技公司完成454焦磷酸测序. 序列数据递交至NCBI SRA数据库(序列号：SRX193676).
1.4 序列分析454测序数据用QIIME V1.4.0软件进行分析[25]. 为保证生物信息学分析质量，对原始数据进行多步质控[12]，包括：①去除序列长度小于150 bp的序列； ②去除含有模糊碱基N的序列； ③去除平均测序准确度低于99.7%的序列； ④去除PCR引物和识别标签中含有模糊碱基的序列； ⑤去除含有超过6个连续同聚体(相同碱基)的序列； ⑥用Acacia V1.52软件进行序列校正[26]. 操作分类单元(operational taxonomic unit,OTU)以97%序列相似度划分，计算多样性指数. 序列用RDP Classifier算法进行种属分类[12].
1.5 病原菌数据库构建及九龙江流潜在域病原菌检测 1.5.1 病原菌16S rRNA基因数据库构建综合文献[14, 17, 27, 28, 29]，从Greengenes(2011版)[30]和Silva SSURef108 database[31]中共收集了283个代表性病原细菌的16S rRNA基因序列(图 2).
 | 图 2 病原菌16S rRNA基因系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of 16S rRNA genes of pathogenic bacteria |
①基于Taylor等[32]总结的病原微生物名录，本研究首先从属(Genus)级别分析了九龙江细菌群落中的潜在病原菌属(即该属中曾有纯系菌株被认定为病原菌)； ②通过序列比对分析(BLASTn,e value≤1e-10； ≥90% coverage)，从九龙江454焦磷酸序列数据中选取出与数据库中病原菌16S rRNA基因序列相似度大于97%(种)和99%(亚种)的序列.
1.6 统计分析应用PAST软件[33]中的Spearman correlation和Mann-Whitney模块分别进行相关分析和显著性检验； 应用Clustering模块(Spearman相关系数)分析九龙江潜在病原菌种群结构的分布趋势，同时用相似性百分比分析(SIMPER)模块(Bray-Curtis指数)分析水体和沉积物中潜在病原菌的分布差异.
2 结果与讨论 2.1 九龙江细菌群落的RDP分类分析
454焦磷酸测序数据经质控分析后，共获得204216条高质量细菌16S rRNA基因序列(每样本5835±1797条序列)，平均长度约为360 bp. 图 3展示了RDP Classifier的种属分类结果. 总体上，约90.8% 的序列可归入34个门(phylum)(图 3). 但随着分类等级降低，可归类的序列数就越少：约87.6%、 79.3%、 59.2%和40.2% 的序列可划分到确定的纲、 目、 科和属(图 3). 水体样品中可分类序列所占比重显著高于沉积物中的(Mann-Whitney test,P<0.001). 这说明，九龙江细菌群落的多样性较高，而当前微生物分类数据库的种种不足(序列数量和分类认识)也是导致以上分类结果的主要因素之一[12,34].
 | 图 3 九龙江浮游和底栖细菌群落的RDP分类结果Fig. 3 RDP classification results of JR planktonic and benthic bacterial communities |
2.2 属级别潜在病原菌多样性分析
与Taylor等[32]总结的病原菌数据库对比分析发现，九龙江细菌群落共含有68个潜在病原菌属(以下简称“病原菌属”)，分别隶属于变形菌门(Proteobacteria)、 放线菌门(Actinobacteria)、 厚壁菌门(Firmicutes)、 螺旋体门(Spirochaetes)、 拟杆菌门(Bacteroidetes)、 梭杆菌门(Fusobacteria)、 柔膜菌门(Tenericutes)和纤维杆菌门(Fibrobacteres)，占序列总量的6.1%(图 4). 其中，Firmicutes、 Proteobacteria和Actinobacteria是丰度最高的3个门，分别占病原菌属序列总量的65.9%、 20%和10.4%. 总体上，68个病原菌属在九龙江水样中均有检出，而沉积物中仅分布有53个属：北溪水体、 北溪沉积物、 西溪水体和西溪沉积物分别分布有49、 44、63和47个病原菌属[图 4(b)]. 进一步深入分析发现，梭菌属(Clostridium)、 分支杆菌属(Mycobacterium)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)是分布最广泛的病原菌属，在所有样品中都有检出，同时也是丰度最高的3个属，分别占病原菌属序列总量的54.5%、 5.9%和5.6%. 而产碱杆菌属(Alcaligenes)、 克雷伯氏菌属(Klebsiella)、 邻单胞菌属(Plesiomonas)、 束村氏菌属(Tsukamurella)、 塞巴鲁德氏菌属(Sebaldella)、 支原体(Mycoplasma)仅在单个样本中检出，其丰度较低(<0.01%)[图 4(b)].此外，需要注意的是，约有59.8%的序列不能划分到确定的属，其中可能包含对人和动植物有致病性的潜在病原菌.
 | 图 4 属级别上九龙江潜在病原菌的种类数和丰度对比Fig. 4 Taxonomic number and relative abundance of potential pathogenic bacterial genus in the Jiulong River |
统计分析表明，九龙江水体中的病原菌属种类(每样本平均28±10个属)显著高于沉积物含有的病原菌属种类(每样本平均18±6个属)(Mann-Whitney test,P<0.001). 西溪水体中的病原菌属种类最多(Kruskal-Wallis test,P<0.05)，丰度最高(Friedman test,P<0.001)，说明西溪水体受病原菌污染的风险较高，对公共卫生安全可能具有较大的潜在危害. 图[4(a)]展示了九龙江流域病原菌属的分布情况：西、 北溪水体中的病原菌属的种类数沿河流流向递减(北溪下游略有增加)，而沉积物中的病原菌属分布则无明显规律. 此外，分布有较多种病原菌属的站位(或样本)，其病原菌属的丰度也较高(spearman correlation,r=0.84,P<0.001)(图 4). 结合环境因子分析发现，九龙江水体中病原菌属的种类数与总无机氮浓度呈显著正相关(spearman correlation,r=0.55,P<0.05)，病原菌属的丰度与无机磷浓度呈显著正相关(spearman correlation,r=0.62,P<0.01). 由于九龙江流域的营养盐输入多来源于城镇建设、 养殖业和农业生产，其浓度和形态组成可以间接反映沿岸人类活动的强度与类型[18, 19, 20]，因此病原菌多样性、 丰度与营养盐之间的阳性相关说明沿岸人类活动可能是病原菌的重要来源[35]. 然而，这些相关关系也有可能是由高浓度营养盐促进病原菌繁殖造成的[21, 22, 36]. 而其他环境因子如温度等，也可能是影响病原菌分布的重要因素[36].
2.3 种水平上潜在病原菌多样性分析Chakravorty等[27]比较110种病原菌16S rRNA基因的V1~V8高变区序列发现，V1~V3高变区是分辨病原菌种的最佳区域. 因此，为了进一步从种级别上明确九龙江流域潜在病原菌的分布特征，本研究采用27F/534R引物对扩增九龙江细菌群落V1~V3区序列，并进行454焦磷酸测序. 此外，本研究总结文献[14, 17, 27, 28]中所列的病原菌种，并进一步结合我国卫生部颁发的病原菌名录[29]，构建了包含283个病原菌种16S rRNA基因序列的本地数据库(分别隶属于7个门、 91个属)(图 2).
BLASTn序列比对分析表明，在97%(种)和99%(亚种)水平，九龙江样品中分别检出48和8种潜在病原菌(以下简称“病原菌种”). 在亚种水平，检出的病原菌种是Staphylococcus saprophyticus、 Escherichia coli、 Streptococcus bovis、 Enterobacter aerogenes、 Staphylococcus epidermidis、 Acinetobacter baumannii、 Aerococcus viridans和Delftia tsuruhatensis，其中Aerococcus viridans的丰度最高. 在种水平，共有1554条九龙江细菌16S rRNA基因序列与参考病原菌序列的相似度高于97%，占序列总量的0.76%[最高为1.7%(WR_S4)，最低为0.12%(NR_W5)]：九龙江水样中共检出46个病原菌种，而沉积物中分布有30个病原菌种. 北溪水体、 北溪沉积物、 西溪水体和西溪沉积物中分别检测到22、 21、 43和22个病原菌种. 进一步深入分析发现，Afipia felis、 Mycobacterium asiaticum、 Clostridium baratii、 Brucella melitensis和Delftia tsuruhatensis是丰度最高的5个病原菌种(种水平)，分别占病原菌种序列总量的48.9%、 20.3%、 8%、 2.7%和1.7%. 此外，Brucella melitensis和Rickettsia rickettsii(在水体中的相对丰度为0.53%)是危害程度为第二类的潜在病原菌[29].
统计分析表明，九龙江水体分布的病原菌种的种类(每样本平均11±7种)显著高于沉积物含有的病原菌种类(每样本平均6±3种)(Mann-Whitney test,P<0.01). 西溪水体中含有的病原菌种的种类最多(Kruskal-Wallis test,P<0.05)，且丰度最高(Friedman test，P<0.001). 此外，线性回归分析表明，九龙江分布的病原菌属与病原菌种的种类数呈显著正相关(R2=0.79,P<0.01)，说明属级别的病原菌检测可为后续的九龙江病原菌污染风险评估提供一定的参考依据. 然而，与属级别分析结果不同的是，仅水体中的病原菌种类数与丰度呈显著正相关(spearman correlation,r=0.63,P<0.01)，但将沉积物样品纳入后，则无显著相关(spearman correlation,P>0.1). 结合环境因子分析发现，九龙江水体分布的病原菌种类数量与总无机氮浓度呈显著正相关(spearman correlation,r=0.54,P<0.05)； 病原菌种的丰度与亚硝态氮浓度呈显著负相关(spearman correlation,r=-0.60,P<0.05)，进一步验证了属级别的分析结果，说明九龙江潜在病原菌的分布与沿岸人类活动存在紧密联系.
图 5展示了基于种水平的九龙江潜在病原菌分布的聚类分析. 分析结果表明，九龙江水体和沉积物的病原菌种的种群结构存在明显差异：所有沉积物样品和西溪水样WR_W1、 WR_W2和WR_W6聚为一大分支，其他水体样品聚为另一分支； 但水样或沉积物样品没有按支流(样本来源)的聚类趋势. SIMPER分析表明，造成水体和沉积物病原菌群落结构差异的主要种是Mycobacterium asiaticum、 Delftia tsuruhatensis、 Staphylococcus_caprae、 Afipia_felis 和Clostridium_baratii. 前3种多分布于水体中，后两种在沉积物中的丰度较高. 然而，这一趋势尚有待于进一步调查研究来验证. 以往的病原菌调查多采用传统的增菌培养和细菌分离法[9, 21, 37, 38]，然而培养法存在局限性，不能全面反映环境中病原菌的分布与构成[1,6]. 本研究采用16S rRNA基因-454焦磷酸测序技术获得大量序列信息，较为全面地反映了九龙江潜在病原菌的分布状况. 由于该流域的ARGs污染状况也较为严重[22,23]，因此了解病原菌的分布状况，可为后续的生态风险评估提供重要资料.
 | 图 5 基于种水平的九龙江病原菌群落结构聚类分析Fig. 5 Cluster analysis of community structures of potential pathogenic bacterial species in the Jiulong River |
(1)基于细菌16S rRNA基因-454焦磷酸测序技术，初步探明了该流域潜在病原菌的污染状况，九龙江流域分布有68个潜在病原菌属. 水体中病原菌属的种类数要多于沉积物中，其中西溪水体分布的病原菌属的种类和丰度最高. 水体中病原菌属的种类数目和丰度随河流流向有衰减趋势，且分别与无机氮和无机磷呈显著正相关，说明九龙江水体中的病原菌可能主要来源于沿岸的人类活动，如养殖业和污水排放等.
(2)构建了包含283种病原菌16S rRNA基因序列的本地数据库. 与数据库对比分析表明，九龙江流域分布有48个病原菌种(与参考序列相似性大于97%). 与属级别的分析结果相似，水体中病原菌种的种类要显著高于沉积物中，其中西溪水体中分布的病原菌种的种类和丰度最高，说明九龙江水体尤其是西溪水体受病原菌污染的风险较高. 水体中病原菌种的种类数与无机氮呈显著正相关，验证了属级别的分析结果. 因此需要进一步开展九龙江流域病原菌污染的风险评估工作.
致谢： 感谢厦门大学环境与生态学院环境管理课题组在样品采集及水样理化性质测定方面的大力支持. 感谢厦门大学陈能汪博士提供九龙江流域图.
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