藻类在水生生态系统中具有重要地位，相比于浮游动物、 鱼类以及发光细菌等生物而言较为低等^[1,2,3,4],5，对有毒物质的胁迫反应更为直接，反应机制较为简单，且自身具有易培养、 繁殖快、 对环境毒物敏感并可直接观察细胞水平上的中毒症状等优点，被多个国家和国际组织作为检测重金属等环境污染物毒性的必需指标生物^[6]，利用藻类进行有毒污染物监测克服了传统理化分析方法耗时长、 无法在线原位测量、 且不具有环境友好性等缺点，被认为是一种切实可行的水体污染物监测方法^[7,8,9].将藻类生物毒性分析方法与传统的理化分析方法相结合，形成水体环境立体监测网络，对保障我国水环境安全具有重要意义.1981年，国际经合组织制定了藻类生长抑制试验的国际标准方法^[10].我国也于2008年发布了《化学品-藻类生长抑制试验》标准方法(GB-T 21805-2008)以确立藻类生物毒性检测方法在水体污染物检测中的重要地位^[11].这一试验方法是以24、 48、 72、 96 h 有毒物质对藻类生长的半数抑制率(EC₅₀)为毒性测试指标，以96 h-EC₅₀为毒性评价依据来表征有毒物质的急性毒性作用程度.该方法简单，得到的结果准确可靠，但试验周期较长，需要重复验证，操作繁琐^[12,13,14].无法满足水质安全预警和污染物应急监测的需求.为了快速监测环境中各污染物对水生生态系统的胁迫和危害，有学者尝试利用叶绿素荧光技术对环境污染物进行检测^[13,14,15].藻类光合活性抑制试验是以叶绿素荧光技术理论为基础，利用体内叶绿素作为天然探针、 研究和探测各种外界因子对其光合活性状况抑制效应的新型毒物测定方法^[16].藻类在受到环境毒物胁迫时，其光合作用电子传递过程被阻断，光化学反应等光合作用的原初反应过程受抑制，光合活性明显下降，导致藻荧光产量增加，光合作用活性的下降与环境毒物的毒性直接相关，可用于环境毒物毒性的检验与评价^[17].该方法具有快速、 灵敏的优点，已被广泛应用于植物光合生理研究中，但该方法受环境因子影响明显^[18,19]，目前，各国尚未发布叶绿素荧光方法的相关标准，无法规范试验程序、 统一环境条件、 保证实验质量.采用国标规定的藻类生长抑制试验方法对光合活性抑制试验结果进行标定，是保障叶绿素荧光方法用于水体污染物毒性检测所得结果准确可靠的前提，选取快速有效的藻类光合活性抑制时间代替96 h藻类生长抑制时间，是实现对水环境进行安全预警和应急监测的基础.

本实验选取近年来水体中污染事件频发的重金属Cd²⁺为监测对象，以蛋白核小球藻为受试生物，采用藻类生长抑制试验和光合活性抑制试验两种方法，对受Cd²⁺胁迫不同时间的藻类生物量和光合荧光参数进行测定，研究96 h藻类生长抑制试验结果与不同毒物胁迫时间下的光合荧光参数的相关性，提高藻类生长抑制试验对毒物检测的时效性，以期为水体毒物毒性监测提供快速可靠的新方法.

1 材料与方法 1.1 材料

实验选取蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa、 FACHB-1222)为受试生物，购自中国科学院水生生物研究所淡水藻种库.选取3CdSO₄ ·8H₂O为检测对象，购自阿拉丁试剂.

1.2 藻种培养方法及参数测定

在1 000 mL的锥形瓶中进行预培养，采用BG-11培养基，培养温度：(20±2) ℃，连续光照，光照度：100 μmol ·(m² ·s)^-1，光暗比：14 h/10 h，pH：7，并进行预试验，以确定合适的重金属浓度范围.

实验在250 mL的锥形瓶中进行，根据预试验的结果，将3CdSO₄ ·8H₂O质量浓度梯度设定为1、 2、 4、 8、 16 mg ·L^-1.将以上各浓度重金属溶液以体积比1 ∶1分别加入处于对数生长期的蛋白核小球藻中(与藻液混合后3CdSO₄ ·8H₂O质量浓度为0.5、 1、 2、 4、 8 mg ·L^-1)，使藻细胞浓度约为1×10⁵ 个 ·mL^-1.每天摇动锥形瓶一次，通过改变培养瓶在光照培养箱中的位置，尽量保持光强一致.以不加重金属的空白组为对照，为每种重金属和对照设定3个平行样.

本实验以藻类叶绿素含量代替藻类生物量.采用浮游植物荧光测量仪(FluoroProbe, 德国BBE公司)和调制式荧光仪Water-PAM(德国WALZ公司)于不同时间对受不同浓度Cd²⁺胁迫蛋白核小球藻的叶绿素含量及PSⅡ系统各荧光参数进行测定.测定时间分别为藻类受Cd²⁺胁迫2、 4、 6、 8、 10、 24、 29、 48、 53、 72、 77、 96 h.测定的光合荧光参数有：本底荧光F0、 最大荧光值Fm、 潜在最大量子效率Fv /Fm、 实际量子效率Yield.

1.3 藻类比生长率和基于比生长率的抑制率的计算

藻类比生长率和基于比生长率的抑制率的计算参见文献[11].

(1)比生长率， 试验期间，不同时间生物量的增长见公式(1)：

(2)以比生长率为基础的抑制率，见式(2)：

1.4 藻活性及藻活性抑制率的计算

(1)藻活性Genty的计算^[20]：

(2)藻活性抑制率Ig的计算^[20]：

1.5 数据处理

用Origin 7.5软件对实验结果进行作图及统计分析，用Sigmoidal函数对藻活性抑制率和比生长抑制率间的关系进行拟合，并用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行方差分析.实验中用于结果分析的数据均为平行样的平均值.

2 结果与讨论 2.1 蛋白核小球藻不同浓度Cd²⁺胁迫作用下叶绿素浓度及藻活性随时间的变化关系

图 1、 图 2为蛋白核小球藻受不同浓度Cd²⁺ 胁迫作用下叶绿素浓度及藻活性荧光值随时间的变化关系.从中可以看出，在Cd²⁺ 质量浓度为2、 4、 8 mg ·L^-1的胁迫作用下，二者随Cd²⁺浓度的增加及胁迫时间的延长而降低，表明该浓度的Cd²⁺已破坏藻类的光合作用的原初反应，阻碍光合电子传递，对藻类的生长产生抑制作用； 在Cd²⁺ 质量浓度为1、 2 mg ·L^-1时，蛋白核小球藻的叶绿素浓度随时间的延长而增加，荧光活性也保持在较高的水平，77 h时藻类Cd²⁺ 处理组的光合活性仍大于对照组，使得96 h叶绿素浓度高于对照组.藻活性可优先于叶绿素浓度的增长来表现藻类生物量的变化趋势.这与吴振斌等^[21]研究得到的低浓度Cd²⁺ 可促进藻类生长的结论相一致.通过分析可知，在不同浓度Cd²⁺ 胁迫作用下随胁迫时间的延长，叶绿素浓度和藻活性表现出较为一致的变化规律，两参数之间具有一定的相关性. 这是因为，活体状态下叶绿素荧光几乎全部来源于PSII反应中心的叶绿素a，叶绿素荧光反映了光合系统PSII反应中心的能量转换效率，即藻类光合活性^[22]，所以藻类荧光活性与叶绿素浓度之间存在必然的相关关系. 下面将进一步对二者的相关关系进行研究.

图 1

Fig. 1

图 1 蛋白核小球藻受不同浓度Cd2+胁迫作用下叶绿素浓度随时间变化关系Fig. 1 Changes in Chlorella pyrenoidosa chlorophyll concentration stressed by different concentrations of Cd2+ with time

图 2

Fig. 2

图 2 蛋白核小球藻受不同浓度Cd2+胁迫作用下藻活性随时间变化关系图Fig. 2 Changes in Chlorella pyrenoidosa photosynthesis activity fluorescence parameters with time stressed by different concentrations of Cd2+

2.2 Cd²⁺不同胁迫时间下藻活性抑制率和96 h比生长率抑制率的相关性分析

《化学品 藻类生长抑制试验》(GB 21805-2008)中说明已经证明一些简单的数学函数可以在藻类生长抑制试验中成功地描述浓度与响应值之间的关系，所有的方程曲线均为渐进的S形曲线^[11]； 吴丰昌等^[23]对用于Cd敏感度分布法进行数据拟合的几种模型进行比较时发现：用Sigmoidal模型拟合物种的毒性数据的决定系数最大，认为可将这种方法作为基准推导的标准参考方法.因此，选用Sigmoidal函数作为回归分析的手段.通过对Cd²⁺不同胁迫时间下藻活性抑制率和96 h比生长率抑制率进行Sigmoidal拟合及ANOVA方差分析，即以国标规定的96 h比生长率抑制率为标准对Cd²⁺胁迫不同时间的藻活性抑制率进行标定，分析结果如表 1所示，两抑制率在24、 48、 53、 72、 77 和96 h Cd²⁺胁迫作用下具有较高的拟合优度系数(R2>0.95)，表现出较好的相关性，且显著性检验的结果F值显示为非显著性不同(其余胁迫时间因为R20.95，说明两变量间不存在明显S函数关系，故不给出拟合关系式)，其中，以48 h和53 h Cd²⁺胁迫作用下的藻活性抑制率和96 h比生长率抑制率相关性最佳.

表 1(Table 1)

表 1 Cd2+不同胁迫时间下藻活性抑制率和96 h比生长率抑制率的S曲线拟合及ANOVA方差分析 1)Table 1 Sigmoidal curve fitting and one-way ANOVA for algal photosynthetic activity inhibition rates at different Cd2+stress times and 96 h inhibition rates of specific growth rate 抑制时间t/h 拟合曲线(Sigmoidal拟合) Chi2/DoF R2 F值 P值 显著性差异 2 — 0.967 1.105E-4 — — — 4 — 1.358 3.33E-16 — — — 6 — 2.757 0.015 — — — 8 — 6.396 0.694 — — — 10 — 3.176 0.097 — — — 24 2.530 0.977 3.548 0.089 非 29 — 83.039 1.348E-9 — — — 48 1.62 0.9994 2.993 0.114 非 53 4.567 0.9985 2.886 0.120 非 72 125.154 0.9708 2.616 0.137 非 77 177.563 0.9625 2.520 0.144 非 96 121.426 0.9692 2.688 0.143 非

表 1 Cd2+不同胁迫时间下藻活性抑制率和96 h比生长率抑制率的S曲线拟合及ANOVA方差分析 1) Table 1 Sigmoidal curve fitting and one-way ANOVA for algal photosynthetic activity inhibition rates at different Cd2+stress times and 96 h inhibition rates of specific growth rate

1)藻类比生长率抑制率为x，藻活性抑制率为y; Chi²/DoF为平均剩余残差平方和，R²为拟合优度系数，F值为单因子方程分析统计指标，P值为置信度

图 3是Cd²⁺胁迫24、 48、 53、 72 和96 h藻活性抑制率和96 h比生长率抑制率间的关系，从中可知：96 h比生长率抑制率与Cd²⁺胁迫48、 53、 72 和96 h藻活性抑制率间具有较为一致S函数变化趋势，同Cd²⁺胁迫24 h藻活性抑制率的变化趋势不同，可能是因为24 h时Cd²⁺对藻的毒害作用尚不明显. 因此，可考虑采用48、 53、 72、 77 和96 h的藻活性抑制率来代替96 h比生长率抑制率来进行藻类毒性实验评价.通过拟合的S函数曲线可以计算得到与96 h藻类比生长率抑制率为50%时相对应的48、 53、 72、 77 和96 h的藻活性抑制率，以此作为评价标准对受试毒物的毒性进行评价(藻类生长抑制毒性分级标准是依据96 h-EC₅₀对毒物毒性进行评价的)^[24].即求出横坐标I_r为50%(96 h-EC₅₀)时所对应Cd²⁺胁迫48、 53、 72 和96 h藻活性抑制率曲线的纵坐标值. 经过内插值计算可知：96 h比生长率抑制率为50%所对应的48、 53、 72 和96 h藻活性抑制率分别为：9%、 9%、 10%、 27%.综合实验时间和曲线拟合误差考虑，以48 h和53 h 藻活性抑制率为10%(即48 h-EC₁₀和53 h-EC₁₀)所对应的毒物浓度为分析参考依据，对水体毒物毒性进行评价所得结果应与藻类生长抑制96 h-EC₅₀的评价结果具有较好的一致性.以藻类光合活性荧光值为测试指标对受试毒物的毒性进行评价可以优化测试时间和测试方法，为利用该方法对水环境生物毒性进行快速安全预警和应急监测提供依据.

图 3

Fig. 3

图 3 蛋白核小球藻受Cd2+胁迫24、 48、 53、 72、 96 h藻活性抑制率和96 h比生长率抑制率关系 Fig. 3 Relationships between algal photosynthetic activity inhibition rates stressed by Cd2+ for 24 h,48 h,53 h,72 h and 96 h respectively and 96 h inhibition rate of specific growth rate

图 4为蛋白核小球藻受Cd²⁺胁迫48 h和53 h藻活性抑制率和毒物毒性当量的剂量-效应关系[1 TU等于Cd²⁺胁迫蛋白核小球藻96 h的平均半数效应浓度(96 h-EC₅₀)]，随着Cd²⁺浓度增加，藻活性抑制率呈上升趋势，说明随Cd²⁺的增加PSII反应中心受到损害加剧，抑制了光合作用的原初反应，阻碍了光合电子传递^[25，26].可以通过对蛋白核小球藻受Cd²⁺胁迫48 h和53 h的藻光合活性荧光值进行测定，对藻活性抑制率进行计算，再根据剂量-效应曲线，得到毒物所对应的毒性当量. 该方法为实验室进行单一Cd²⁺的毒性监测提供了一种新思路，可用于对受试毒物的毒性进行评价，为进一步研究水体的综合毒性以及对水质进行快速安全预警和应急监测提供理论依据.

图 4

Fig. 4

图 4 蛋白核小球藻受Cd2+胁迫48 h和53 h藻活性抑制率和毒物毒性当量的剂量-效应关系 Fig. 4 Dose-response relationship between algal photosynthetic activity inhibition rates stressed by Cd2+ for 48 h and 53 h and toxicant toxic equivalency quantity

(1)蛋白核小球藻受不同浓度Cd²⁺胁迫作用下，叶绿素浓度及藻活性荧光值随时间具有较为一致的变化规律.

(2)可采用48、 53、 72、 77 和96 h藻活性抑制率代替96 h比生长率抑制率进行藻类毒性实验评价.综合实验时间和曲线拟合误差考虑，以48和53 h 藻活性抑制率为10%(即48 h-EC₁₀和53 h-EC₁₀)所对应的毒物浓度为毒性评价依据较为合理.

(3) 通过对蛋白核小球藻受Cd²⁺胁迫48 h和53 h藻活性抑制率和毒物当量的剂量-效应关系进行研究，得到毒物所对应的毒性当量，该方法为实验室进行单一Cd²⁺的毒性监测提供了一种新思路.