环境科学  2014, Vol. 35 Issue (4): 1486-1490   PDF    
引用本文
陈丽红, 刘征涛, 方征, 王晓南, 王婉华. 老化土壤中铅对赤子爱胜蚓生长及繁殖的影响[J]. 环境科学, 2014, 35(4): 1486-1490.
CHEN Li-hong, LIU Zheng-tao, FANG Zheng, WANG Xiao-nan, WANG Wan-hua. Effects of Lead on the Growth and Reproduction of Eisenia fetida with Aged Soils[J]. Environmental Science, 2014, 35(4): 1486-1490.
老化土壤中铅对赤子爱胜蚓生长及繁殖的影响
陈丽红1, 刘征涛1, 方征1, 王晓南1,2, 王婉华1    
1. 中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室,国家环境保护化学品生态效应与风险评估重点实验室,北京 100012;
2. 北京师范大学水科学研究院,北京 100875
收稿日期：2013-8-30; 修订日期： 2013-10-22.
基金项目： 环境保护公益性行业科研专项（201109054）
作者简介：陈丽红(1980~),女,硕士,主要研究方向为生态毒理学,E-mail:red-cup@163.com
通讯联系人，E-mail:wangwh@craes.org.cn
摘要：采用赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）为测试生物，人工土壤为测试介质，Pb（NO3）2为土壤污染物，研究土壤老化对赤子爱胜蚓生长及繁殖的影响.结果表明，与对照组相比，污染土壤中赤子爱胜蚓体重随土壤中Pb（NO3）2浓度的升高呈现降低的趋势.Pb（NO3）2在人工土壤中老化0、7、28和84 d 后，不同老化时间，Pb（NO3）2抑制赤子爱胜蚓的生长也不相同，影响最明显的是1000 mg·kg-1和1500 mg·kg-1试验组.不同老化时间的Pb（NO3）2对赤子爱胜蚓繁殖的影响有很大差异，其产茧量的半数有效浓度（EC50）分别为1085.10、1163.32、1666.86和1606.94 mg·kg-1；幼蚓孵化量的EC50分别为700.01、703.88、1031.34和1017.89 mg·kg-1.Pb（NO3）2在人工土壤中经过不同老化时间后，其对赤子爱胜蚓生长及繁殖的影响有很大的差异，这种差异影响到对土壤Pb（NO3）2污染的毒性评估，因此，进行Pb（NO3）2毒性试验时应考虑其在土壤中的老化作用.此研究结果可为老化土壤中污染物的生态风险评估以及土壤环境质量标准的制定提供科学依据.
关键词： 土壤老化     铅     赤子爱胜蚓     生长     繁殖    
Effects of Lead on the Growth and Reproduction of Eisenia fetida with Aged Soils
CHEN Li-hong1, LIU Zheng-tao1, FANG Zheng1, WANG Xiao-nan1,2, WANG Wan-hua1    
1. State Key Laboratory for Environmental Criteria and Risk Assessment, State Environmental Protection Key Laboratory of Ecological Effects and Risk Assessment of Chemicals, Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012, China;
2. School of Water Science Research, Beijing Normal University, Beijing 100875, China
Abstract: In this study, effects of Pb(NO3)2 on the growth and reproduction of Eisenia fetida were investigated with artificial soils. The results showed that: compared with the control group, the growth of E. fetida in contaminated soil was inhibited significantly with increasing Pb(NO3)2 concentrations. But there were great differences in the extent of inhibition after 0, 7, 28 and 84 days of aging in the artificial soils. The most obvious effect occurred in 1000 mg·kg-1 and 1500 mg·kg-1 experimental groups. There was a very big difference in the effects of Pb(NO3)2 on reproduction of E. fetida with different aging times. The medium effective concentration(EC50)values of cocoon production inhibition were 1085.10, 1163.32, 1666.86 and 1606.94 mg·kg-1. In addition, the EC50 values of the number of juvenile inhibition were 700.01, 703.88, 1031.34 and 1017.89 mg·kg-1, respectively. This study indicates that soil aging which affects the toxicity of Pb(NO3)2 should be taken into consideration when toxicity tests of Pb(NO3)2 were carried out.The results could provide a scientific basis for the ecological risk assessment of aging soils and soil environmental quality standards.
Key words: soil aging     lead     Eisenia fetida     growth     reproduction    

目前，全世界平均每年排放Pb约500万t，其中大部分进入土壤，致使世界各国土壤出现不同程度的Pb污染[1,2,3].土壤Pb超标不仅影响植物体的正常生长，而且通过食物链危害人类健康，长期或过量摄入Pb会引起人体神经系统、 消化系统、 造血系统和肾脏的损害等中毒反应[4,5,6].近年来，我国儿童血Pb中毒事件频发，对儿童的智力发育和生长发育产生极大的影响.

蚯蚓作为土壤无脊椎动物的代表，在评价土壤生态系统的污染方面起着重要作用[7,8,9].目前关于Pb对蚯蚓的毒理学研究报道很多[10,11,12]，然而多数主要采用新加污染物的人工土壤模拟重金属污染，并没有考虑污染物在土壤中的老化作用[14, 15]，即水溶性重金属加入土壤后，迅速完成固-液分配，其生物有效性或毒性随时间延长而逐渐降低的特性[16,17,18].正是由于老化作用，使得田间污染土壤中的生物有效性或毒性与添加重金属的人工土壤中的生物有效性或毒性存在着较大的差异.大量研究表明，重金属在土壤中经过长时间老化后，其存在形态发生了变化，有效态浓度降低[19, 20]. Lock等[21]研究了土壤老化对Cu生物有效性的影响，结果表明：新加入Cu的土壤，其孔隙水中Cu的浓度和0.01 mol ·L-1 CaCl2提取的Cu形态，要显著高于经过长时间老化的土壤中相应的Cu浓度； 此外，Cu的毒性效应与孔隙水中Cu的浓度或者CaCl2提取的Cu形态之间具有剂量-效应关系. Bruus Pedersen等[22]的研究同样表明：土壤老化对弹尾目昆虫的繁殖产生了很大影响.

因此，本试验利用赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)为测试生物，Pb(NO3)2为土壤污染物，人工土壤为测试介质，土壤分别经过0、 7、 28和84 d老化后，研究土壤老化对赤子爱胜蚓生长及繁殖的影响，以期为老化土壤中污染物的生态风险评估以及土壤环境质量标准的制定提供科学依据.

1 材料与方法 1.1 试剂与材料

Pb(NO3)2(分析纯)、 CaCO3 (分析纯)、 石英砂和高岭土均购自国药集团化学试剂有限公司； 草炭购自北京市来广营花卉市场.

1.2 试验蚯蚓

试验所有蚯蚓为赤子爱胜蚓，购自北京坤龙养殖中心，新购置的赤子爱胜蚓以牛粪土和草炭的混合物作为饲养基质，在室温20~25℃、 自然光照条件下长期繁殖与饲养，选取行为活跃、 体色鲜亮、 体质量300~600 mg、 有生殖环的性成熟赤子爱胜蚓用于试验.试验前将赤子爱胜蚓放在与试验相同的环境条件下驯养7 d后再进行正式试验.

1.3 试验土壤

试验土壤采用OECD[23]标准人工土壤：70%的石英砂、 20%的高岭土、 10%的草炭，用CaCO3将pH调节至7.0±0.3.

1.4 生长、 繁殖试验

试验按照OECD[23]的方法进行，选择6个浓度组进行赤子爱胜蚓繁殖试验，其Pb(NO3)2浓度分别为0、 250、 500、 1 000、 1 500、 2 000 mg ·kg-1.先将适量的Pb(NO3)2配制(通过母液稀释)成50 mL的水溶液，分别加入到500 g干燥人工土壤中，充分混匀后，再用去离子水将土壤湿度调节至其持水量的35%，已配好的人工土壤分别经过0、 7、 28和84 d老化后用于试验.试验所用赤子爱胜蚓被随机分成10条一组，每组称重后放在人工土壤表面，待赤子爱胜蚓钻蛀进入人工土壤后，在土壤表面均匀撒布5 g燕麦片作为赤子爱胜蚓的食物，并喷洒适量去离子水使燕麦片湿润，然后将玻璃烧杯移入人工气候箱内，在光照周期16 ∶8、 光照强度600~1 000 lx、 温度20℃±1℃、 湿度80%的条件下培养.第28 d时对赤子爱胜蚓称重后不再放回人工土壤中，第56 d时用湿筛法将土壤中的茧和幼蚓挑出和计数，试验前5周每周给赤子爱胜蚓添加1次燕麦片，多余的食物及时清除，以避免细菌繁殖.每个测试浓度重复4次.

赤子爱胜蚓体重变化率按以下公式进行计算：

式中，W0和Wt分别是赤子爱胜蚓的初始体重和暴露在污染物中第28 d时的体重.

1.5 统计分析

所用数据统计均采用SPSS 20.0软件进行分析. EC10(10%有效浓度)和EC50(半数有效浓度)通过直线回归法求出，NOEC(无可见效应浓度)按照OECD[24]方法在P=0.05 的显著水平上采用Dunnetts 多重比较检验方法求出.数据以平均值±标准差(±SD)表示.

2 结果与讨论 2.1 Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓生长的影响

整个试验过程中，试验组和对照组均未出现赤子爱胜蚓死亡现象.所有对照组的赤子爱胜蚓体重变化率均为正值，体重都比试验初始有所增加，生长状态良好，说明培养的营养条件可以保证赤子爱胜蚓生长的需要.

Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓的生长抑制见图 1.结果表明，在人工土壤中老化0、 7、 28和84 d 后，各试验组Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓体重变化率的影响基本一致，赤子爱胜蚓的体重变化率呈显著的剂量-效应关系，表现为随着土壤中Pb(NO3)2浓度的增加，各试验组赤子爱胜蚓的体重与对照组比较明显降低.当土壤中Pb(NO3)2浓度为2 000 mg ·kg-1时，对赤子爱胜蚓体重的抑制率均达到最大，分别为36.81%、 31.59%、 33.03%和36.14%.土壤老化对赤子爱胜蚓体重变化影响最大的是1 000 mg ·kg-1和1 500 mg ·kg-1试验组，当土壤老化84 d时，其体重比老化0 d时分别增加了5.79%和4.32%(P<0.01).

图 1 在老化土壤中Pb(NO3)2作用下赤子爱胜蚓的体重变化率 Fig. 1 Rate of weight change of Eisenia fetida exposed to Pb(NO3)2in aged soils Pb(NO3)2/mg ·kg-1: 1.0，2.250， 3.500，4.1 000，5.1 500，6.2 000； *表示与对照组比较，P<0.05； **表示与对照组比较，P<0.01； #表示与老化0 d比较，P<0.05；##表示与老化0 d比较，P<0.01，下同

总体来说，与对照组相比，污染土壤中赤子爱胜蚓体重随土壤中Pb(NO3)2浓度的升高呈现降低的趋势.说明Pb(NO3)2污染严重影响了蚯蚓的生长，对其体重产生了明显的抑制作用.此外，Pb(NO3)2抑制赤子爱胜蚓生长发育，还与赤子爱胜蚓的自然生存策略(如为了减轻毒性，通过减少食物的摄入来避免污染物对机体的损伤)有关[25].Maboeta等[26]研究了食物中(牛粪)加入Pb(NO3)2对掘穴环爪蚓生长的影响，结果表明：暴露76 d后，试验组掘穴环爪蚓的生长与对照组相比显著降低.此外，土壤不同老化时间，Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓的体重抑制率也不相同，其中影响最明显的是1 000 mg ·kg-1和1 500 mg ·kg-1试验组.因而体重变化率可以成为Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓毒性的一个敏感指标.

2.2 Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓繁殖的影响 2.2.1 Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓产茧量的影响

由图 2可见，Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓产茧量的抑制作用表现为随老化时间延长呈现出逐渐降低的趋势，且产茧量随着土壤中Pb(NO3)2浓度的升高呈现出逐渐下降的趋势.在Pb(NO3)2浓度为1 000、1 500和2 000 mg ·kg-1试验组，老化28 d土壤中的赤子爱胜蚓产茧量分别为19.5、15.2和10.2个，比老化0d时的产茧量(16.2、9.7、5.5个)分别增加20.4%、56.7%和85.4% (P <0.05)；到老化84 d时，赤子爱胜蚓产茧量分别为23.0、18.5和9.7个，比老化0 d分别增加了41.9%、90.7%和76.3% (P<0.05)；但与老化28 d时的产茧量相比只增加了17.9%、21.7% 和-4.9%.

图 2 在老化土壤中Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓产茧量的影响 Fig. 2 Effect of Pb(NO3)2 on cocoon production of Eisenia fetida in aged soils

方差分析结果表明，当Pb(NO3)2浓度高于1 000 mg ·kg-1时，老化28 d和84 d的人工土壤中Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓产茧量的抑制作用与老化0 d的人工土壤比较有显著差异(P<0.05).

2.2.2 Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓幼蚓孵化量的影响

由图 3可见，在Pb(NO3)2浓度为500、 1 000、 1 500和2 000 mg ·kg-1的试验组中，老化28 d土壤中的赤子爱胜蚓幼蚓孵化量从老化0 d时的26.5、 18.5、 11.7和4.0条分别增加到36.2、 26.7、 16.2和7.5条，增加了36.6%、 44.3%、 38.4%和87.5%； 到老化84 d时，幼蚓孵化量比老化0 d时分别增加52.8%、 65.5%、 74.8%和37.0%； 但与老化28 d时土壤中的幼蚓孵化量相比只增加12.2%、 13.8%、 27.8% 和-26.8%.方差分析结果表明，当Pb(NO3)2浓度高于500 mg ·kg-1时，老化28 d和84 d的人工土壤中Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓幼蚓孵化量的抑制作用与老化0 d的人工土壤比较有显著差异(P<0.05).

图 3 在老化土壤中Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓幼蚓孵化量的影响 Fig. 3 Effect of Pb(NO3)2 on number of juvenile of Eisenia fetida in aged soils

2.2.3 Pb(NO3)2影响赤子爱胜蚓产茧量和幼蚓孵化量的EC10、 EC50和NOEC

由表 1可见，土壤老化0、 7、 28和84 d后，Pb(NO3)2影响赤子爱胜蚓产茧量和幼蚓孵化量的EC10、 EC50和NOEC.在开始的0~28 d老化时间内，Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓产茧量和幼蚓孵化量的影响明显，随后28~84 d老化对其的影响逐渐变弱，趋于平衡.

表 1 在老化土壤中Pb(NO3)2影响赤子爱胜蚓繁殖的EC10、 EC50和NOEC Table 1 EC10, EC50 and NOEC reproduction values of Eisenia fetida exposed to Pb(NO3)2 in aged soils

目前，仅有少量研究关于Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓繁殖的影响，Spurgeon等[27]的研究表明，在新添加Pb(NO3)2的人工土壤中，其抑制赤子爱胜蚓产茧量的56 d-EC50为1 940 mg ·kg-1.本试验中Pb(NO3)2在老化0、 7、 28和84 d的人工土壤中抑制赤子爱胜蚓产茧量的28 d-EC50分别为1 085.10、 1 163.32、 1 666.86和1 606.94 mg ·kg-1，表明Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓繁殖的影响受试验持续时间、 土壤老化等因素影响.

Bruus Pedersen等[22]研究表明：Cu在土壤中未经老化时，对弹尾目昆虫繁殖的EC10和EC50分别为700 mg ·kg-1和1 400 mg ·kg-1； 而当土壤老化后，即使土壤中Cu浓度高达2 500 mg ·kg-1时，其对弹尾目昆虫繁殖的影响与对照组比较无显著差异(P>0.05).由此可见，土壤是否经过老化，对动物繁殖的影响有很大差异.

研究表明，经过老化后土壤中重金属的存在形态发生了变化，生物有效性或毒性随着与土壤接触时间的延长而降低，且老化效应主要发生在与土壤初始接触的阶段[19,20,28,29,30].本试验也表明，Pb(NO3)2在土壤中老化0、 7、 28和84 d后，其对赤子爱胜蚓繁殖的影响有很大的差异.土壤中Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓产茧量和幼蚓孵化量的影响在开始的0~28 d老化时间内明显，随后28~84 d老化对其的影响逐渐变弱，趋于平衡.由此可以看出，Pb(NO3)2在土壤中是否老化，将极大地影响其对赤子爱胜蚓繁殖的毒性，因此，在进行Pb(NO3)2毒性试验时应考虑土壤的老化作用.尤其是以赤子爱胜蚓繁殖为测定指标时，为模拟更接近于自然界的真实情况，应考虑在实验室中对Pb(NO3)2进行老化.

因而，本试验在老化土壤中Pb(NO3)2对赤子爱胜蚓幼蚓生长及繁殖的研究结果，可为土壤污染控制及生态风险评价提供科学依据，也可为土壤质量基准与标准的制定提供基础毒理数据[7,31,32]； 由于现行的《土壤环境质量标准》(GB 15618-1995)，都是建立在新加污染物的试验条件下产生的生物效应和生态毒理数据基础上，往往高估了其生态风险.因此，在对《土壤环境质量标准》作进一步修订时，应考虑土壤的老化作用.

3 结论

(1)与对照组相比，污染土壤中赤子爱胜蚓体重随土壤中Pb(NO3)2浓度的升高呈现降低的趋势.Pb(NO3)2在人工土壤中老化0、 7、 28和84 d 后，不同老化时间，Pb(NO3)2抑制赤子爱胜蚓的生长也不相同，其中影响最明显的是1 000 mg ·kg-1和1 500 mg ·kg-1试验组.

(2) Pb(NO3)2在人工土壤中老化0、 7、 28和84 d后，对赤子爱胜蚓繁殖的影响有很大差异，其产茧量的EC50分别为1 085.10、 1 163.32、 1 666.86和1 606.94 mg ·kg-1； 幼蚓孵化量的EC50分别为700.01、 703.88、 1 031.34和1 017.89 mg ·kg-1.

(3) 当土壤老化28和84 d时，Pb(NO3)2浓度高于1 000 mg ·kg-1和500 mg ·kg-1时，分别对赤子爱胜蚓产茧量和幼蚓孵化量的抑制作用与老化0 d时比较有显著差异.

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