试验区位于中国科学院东北地理与农业生态研究所哈尔滨试验场，通过自制的OTC-1型开顶式气室进行臭氧熏气试验^[11].开顶式气室主体高为2.0 m，直径为3.5 m，横截面为正八边形，正八面柱体顶端增加45°收缩口，收缩口高为1.0 m，用以减少外部气体对室内气体的影响，整个气室的体积约为25 m³.气室框架由方形钢管与聚乙烯薄膜(透光率≥ 90%)构建，主要由过滤系统、 臭氧发生与加入系统、 通风及布气系统、 臭氧浓度控制系统与数据自动采集系统组成.臭氧由山东省济南市三康电器有限公司生产的臭氧发生器产生，加入到经过活性炭过滤的大气中，由功率为750 W的轴流风机通入气室内，通过调节流量计使气室内臭氧浓度保持在目标浓度范围，通过臭氧分析仪(Themofisher，i49，美国)进行即时监测与记录.试验过程中通风与布气系统可以满足气室内气体每min交换1次以上，使得气室内温度湿度与CO₂浓度等环境因素与外界基本保持一致.

试验设3个处理：过滤大气(CFA，约10 nL ·L^-1)，自然大气(NFA)与自然大气添加40 nL ·L^-1(NFA+O₃)，每个处理3个OTC重复，每个OTC内种植4盆大豆，每盆3株.于2012年6月20日(始花期)开始熏气，9月11日停止熏气直至大豆成熟收获.每日熏气最长时间为8 h(北京时间09:00～17:00)，阴雨天气停止熏气.

试验材料为中国科学院东北地理与农业生态研究所选育的大豆品种“东生1号”(黑审豆2003017).供试土壤为典型黑土，pH 6.5，有机质26.8mg ·kg^-1, 全氮2.1mg ·kg^-1.采取盆栽方式，将黑土与河沙按体积比1 ∶1混匀后装入圆形桶(直径40 cm，高30 cm)，每盆15 kg，并且以种肥方式一次性施入分析纯KH₂PO₄ 3.29 g, 尿素3.26 g.于2012年5月20日统一播种于盆中约3 cm深的土壤中，出苗后每盆保留长势一致幼苗3株.整个试验期内保证植株充足且等量的水分供应、 光强，温度和病虫害等不成为限制因子.

于盛花期(7月7日)选取冠层上部2片全展相同叶位叶片进行光合色素含量测定.新鲜叶片用体积分数为95%乙醇提取，于664、 648与470 nm处测定吸光度.根据Lichtenthaler^[12]修正公式计算叶绿素a(Chl a)、 叶绿素b(Chl b)、 叶绿素总量(Chl a+b)和类胡萝卜素(Car)含量.

于盛花期(7月7日)晴天上午09:00～11:00，每个OTC选取4株大豆上部全展相同叶位叶片3片，用Li-6400便携式光合测定仪荧光叶室(Li-Cor，Inc，美国)进行测定.测定光强设定为1200 μmol ·(m² ·s)^-1，CO₂浓度为380 μmol ·mol^-1，空气流速为0.5 L ·s^-1，气温控制在(34±1)℃，相对湿度(55±5)%.

于盛花期(7月7日)与鼓粒期(8月27日)，每个OTC内取3株大豆，将叶片清洗干净，105℃杀青20 min后，于80℃烘干48 h至恒重.植株成熟收获后，将大豆籽粒于80℃烘干至恒重后，将各其磨碎经元素分析仪(Virio EL Ⅲ，Elemetar Inc，德国)测定C、 N元素含量并得出碳氮比.

植株成熟收获后测产、 考种，测定大豆株高、 主茎节数、 单株荚数与百粒重.

所有试验数据以OTC为重复单元，即3个重复.采用SPSS 16.0统计软件对数据进行方差分析(ANOVA).文中数据均为平均值±标准差.

试验期间实际臭氧熏气天数为68 d. OTC内日平均温度与相对湿度分别为22.4℃与83.1%(变化范围70%~95%)，OTC外日平均温度与相对湿度分别为21.8℃与73.8%(变化范围45%~98%).每日熏气期间(8 h)平均光合有效辐射为624 μmol ·(m² ·s)^-1.

大豆是对O₃胁迫最为敏感的作物之一(大于40 nL ·L^-1即可造成氧化伤害)^[13]，因此参考Fuhrer等^[14]计算公式：，计算出整个处理期间CFA、 NFA与NFA+O₃下AOT40值(即每小时O₃浓度高于40 nL ·L^-1的累积总和)，分别为0、 0.03与10.6 μL ·L^-1 ·h(表 1).试验期间，NFA小时最高值出现在8月13日，为44.5 nL ·L^-1，NFA+O₃小时最高值出现在8月26日，为85.4 nL ·L^-1.

表 1(Table 1)

表 1 试验期间各处理每日O3平均浓度与AOT40值Table 1 Daily mean O3 concentrations with ozone treatments and AOT40 values 项目 CFA NFA NFA+O3 每日8 h平均值/nL·L-1 9.9 19.1 58.6 臭氧日平均最大值/nL·L-1 15.6 35.2 58.6 臭氧日平均最小值/nL·L-1 2.1 9.9 48.1 小时平均浓度最高值/nL·L-1 15.6 44.5 85.4 AOT40值/μL·L-1·h 0 0.03 10.6

表 1 试验期间各处理每日O3平均浓度与AOT40值Table 1 Daily mean O3 concentrations with ozone treatments and AOT40 values

与CFA相比，NFA处理降低东生1号大豆单株产量4.5%，无显著差异(P>0.05)，而NFA+O₃处理显著降低单株产量，达34%(P<0.05)，减产作用显著高于NFA处理(表 2). 但是， 3个处理间株高、 主茎节数、 单株荚数与每荚粒数均未无显著差异，尽管NFA+O₃处理的单株荚数与每荚粒数分别比CFA降低27%与13%，但未达到显著水平. CFA与NFA间百粒重也无显著差异，只降低4%，而NFA+O₃处理籽粒百粒重比CFA显著降低18%(P<0.05).由于单株产量与单株结荚数之间呈显著正相关(r=0.459^*，P<0.05)，与百粒重之间呈极显著正相关(r=0.667^**，P<0.01)，表明单株荚数与百粒重在决定东生1号产量上具有显著作用(表 3).

表 2(Table 2)

表 2 不同O3处理对东生1号单株产量及其构成要素的影响Table 2 Effects of different O3 concentrations on yield and yield components of soybean cultivar Dongsheng No.1 项目 CFA NFA NFA+O3 单株产量/g·株-1 15.6±1.1a 14.9±2.5 a 10.2±2.8 b 株高 61.5±5.2a 57.0±4.5 a 56.4±5.4 a 主茎节数 14.1±1.3a 13.8±1.0 a 13.3±1.1 a 单株荚数 26.2±7.1a 24.7±5.4 a 19.3±7.0 a 每荚粒数 2.3±0.1a 2.2±0.6 a 2.0±0.4 a 百粒重 22.5±1.7a 21.6±2.0 a 18.4±1.8 b

表 2 不同O3处理对东生1号单株产量及其构成要素的影响Table 2 Effects of different O3 concentrations on yield and yield components of soybean cultivar Dongsheng No.1

表 3(Table 3)

表 3 东生1号单株产量与其构成要素之间的相关系数1)Table 3 Correlation coefficients between yield and yield components in soybean cultivar Dongsheng No.1 株高 主茎节数 单株荚数 每荚粒数 百粒重 单株产量 0.158 0.273 0.459* -0.148 0.667** 株高 0.413* 0.507** 0.174 0.116 主茎节数 0.672** 0.191 0.215 单株荚数 0.055 0.297 每荚粒数 -0.303 1)*为P<0.05，**为P<0.01

表 3 东生1号单株产量与其构成要素之间的相关系数1)Table 3 Correlation coefficients between yield and yield components in soybean cultivar Dongsheng No.1

以CFA处理东生1号产量为基准值，NFA与NFA+O₃产量与之比值为相对产量.以试验期间O₃暴露累积值AOT40值为横坐标，单株相对产量为纵坐标，得出相对产量与AOT40值之间的线性相关关系为y=-0.030x+0.977(r²=0.725^*，P<0.05).AOT40值和东生1号单株相对产量存在显著负相关关系，并且根据曲线可以计算出东生1号大豆减产10%的AOT40值为2.6 μL ·L^-1 ·h，即当大气中O₃浓度高于40 nL ·L^-1的小时累积效应指数达到2.6 μL ·L^-1 ·h时，将造成大豆单株产量减少10%.

盛花期3个处理间植株中上部叶片C、 N元素含量与C/N比均无显著差异.随着O₃暴露时间延长，鼓粒期3个处理叶片C, N元素含量及比例发生变化(图 1).与CFA相比，NFA处理植株叶片C与N元素含量与C/N比无显著变化，NFA+O₃处理植株叶片C与N元素含量分别显著升高3%与26%，而C/N比显著降低18%.与CFA相比，NFA+O₃处理籽粒中N元素含量升高3%，碳氮比降低3%，均未达到显著水平.

图 1

Fig. 1

图 1 不同O3处理对东生1号叶片与籽粒C、 N元素及C/N比的影响Fig.1 Effects of different O3 concentrations on C and N concentrations in leaf and seed of soybean cultivar Dongsheng No.1

与CFA相比，NFA+O₃处理显著降低盛花期东生1号叶片A_sat、 g_s和WUE，分别降低47%、 41%和30%，而胞间CO₂浓度(ci)未受到显著影响.NFA+O₃处理引起叶片开放的光系统Ⅱ反应中心的激发能捕获效率(F′ _v/F′ _m)和光系统Ⅱ的实际量子效率(PSⅡ)分别显著下降12%与22%(P<0.05)，光化学猝灭系数(qP)也降低11%，但未达到显著水平(表 4).盛花期3个处理下大豆叶片光合色素含量与比例均无显著差异.

O₃胁迫引起作物减产，并且这种负面影响有累积效应.基于全球臭氧监测数据的评估结果表明，O₃污染(以每日平均浓度M12与暴露剂量AOT40值为指标)导致2000年全球大豆、 小麦和玉米分别减产8.5%~14%、 3.9%~15%和2.2%~5.5%^[15].O₃污染已经导致我国长江三角洲地区部分作物减产.以水稻和冬小麦为例，1999年水稻和冬小麦分别减产59.9万t和66.9万t，相应的经济损失分别超过5.39亿元和9.36亿元^[16]； 2003年水稻与冬小麦分别减产3.04%与17.08%，经济损失达到5.76亿元与7.68亿元^[17].

大豆是对O₃最敏感的作物之一， O₃浓度达到50~60nL ·L^-1时，大豆减产22%^[13].模型预测，至2050年，在O₃浓度升高20%的前提下，与当今粮食产量相比，大豆将进一步减产12%^[18].针对亚洲地区的研究表明：环境O₃浓度在35~75 nL ·L^-1范围内，经过一个生长季(4~8 h)豆类减产范围在10%~65%^[19].本试验中，O₃平均浓度为58.6 nL ·L^-1，经过一个生长季处理，东生1号大豆单株产量较洁净大气处理显著降低34%，相比美国大豆品种Pioneer 93B15减产20%(O₃浓度50~63 nL ·L^-1，每天暴露8 h)^[20]，说明我国东北大豆对O₃胁迫响应可能更为敏感.这一方面与品种间臭氧敏感性差异有关，另一方面与臭氧熏蒸方式有关，OTCs内温度、 湿度等环境因子与开放式熏气系统(FACE)相比通常较高，有可能造成内部植株具有更大的气孔开度，导致通过气孔进入叶片内部的O₃通量较大，造成单株减产更为严重.

表 4(Table 4)

表 4 不同O3处理对盛花期东生1号叶片气体交换、 叶绿素荧光参数与光合色素含量的影响Table 4 Effects of different O3 concentrations on gas exchange, chlorophyll a fluorescence parameters and photosynthetic pigments in soybean cultivar Dongsheng No.1 at the full bloom stage 项目 CFA NFA NFA+O3 Asat 26.4±1.7 a 25.5±1.2 a 13.9±2.8b gs 0.67±0.02 a 0.61±0.04 a 0.39±0.10b ci 268.1±2.3 a 270.5±2.1 a 274.8±13.8a WUE 2.72±0.46 a 2.57±0.28 a 1.89±0.53b F′v/F′m 0.62±0.01 a 0.62±0.03 a 0.54±0.04b ΦPSⅡ 0.37±0.01 a 0.29±0.03 a 0.36±0.02b qP 0.59±0.02 a 0.58±0.03 a 0.53±0.06a 叶绿素a/g·m-2 0.39±0.02 a 0.45±0.03a 0.37±0.10a 叶绿素b/g·m-2 0.13±0.01a 0.15±0.01a 0.13±0.03a 叶绿素a+b/g·m-2 0.53±0.03a 0.60±0.04a 0.49±0.13a 类胡萝卜素/g·m-2 0.11±0.02 a 0.12±0.01a 0.10±0.02a 叶绿素a/b 3.02±0.18 a 3.08±0.01a 2.94±0.14a

表 4 不同O3处理对盛花期东生1号叶片气体交换、 叶绿素荧光参数与光合色素含量的影响Table 4 Effects of different O3 concentrations on gas exchange, chlorophyll a fluorescence parameters and photosynthetic pigments in soybean cultivar Dongsheng No.1 at the full bloom stage

百粒重是大豆产量构成的重要因素之一，与产量呈正相关关系.本试验中，O₃胁迫导致东生1号大豆籽粒百粒重显著降低，而对株高、 单株荚数与每荚粒数无显著影响.这一结果与采用OTCs方式对夏大豆品种菏豆12的研究(O₃浓度80nL ·L^-1，初花期开始熏气，每天8 h)结论相似^[21].然而，同样采用相同熏气方式、 熏气浓度与时间的研究结果却表明，80 nL ·L^-1 O₃胁迫造成菏豆12单株籽粒重显著降低20%，对百粒重无显著影响，单株荚数和单株籽粒数的降低是单株籽粒重降低的主要原因^[22].可见，相同熏气方式、 熏气浓度与时间对不同大豆品种的影响受到气候条件等因素的影响.

产量损失是O₃胁迫对作物生长发育产生伤害的最终结果，与光合作用固定的同化物以及同化物在植物体内的分配密切相关.O₃胁迫导致作物减产通常是由光合能力降低以及供应繁殖器官生长发育的营养物质的吸收能力降低所致^[23].对大豆来说，花期出现或者开花期之后，叶片生长大部分停止.在这一时期，冠层上部叶片成为供应籽实鼓粒光合同化物的最主要来源直至植株衰老^[20].以往研究结果表明：O₃暴露下，鼓粒期大豆减产幅度最大，这是因为冠层上部的叶片，通常处在阳光之下，具有较大的气孔导度，它们累积吸收的O₃通量超过其他叶片，因此导致大豆大幅度减产^[27].本研究发现，与较洁净和自然大气处理相比，高浓度O₃暴露导致东生1号叶片净光合速率与气孔导度显著降低，这与前人的研究结果相似^{[27, 28]}.

气孔是限制O₃进入叶内部最主要的因子，在一定程度上是造成植物O₃敏感性差异最重要的原因^{[24, 25]}.气孔导度降低可能是植物避免O₃胁迫的一种反应，取决于叶片特性、 O₃浓度、 持续伤害时间及其它环境因素^[26].本研究发现，虽然高浓度O₃暴露导致植株气孔导度显著降低，而叶片胞间CO₂浓度(ci)维持不变，该结果表明：高浓度O₃引起的气孔导度降低是东生1号叶片净光合速率降低的结果，而非其他原因^[29]，这与在夏大豆上的研究结果略有不同^[30].从测定的光合生理指标变化来看，光系统Ⅱ电子传递与捕获效率的下降是高浓度O₃引起净光合速率显著降低的主要原因.

高浓度O₃处理导致东生1号叶片N元素含量随着暴露时间延长显著升高，C/N比显著降低，说明O₃胁迫对大豆氮代谢具有明显的影响，这一结果与郑飞翔等^[31]在水稻上的研究结果一致.此外，高浓度O₃处理引起大豆籽粒碳氮元素显著升高，这与对春小麦^[32]和水稻^[33]的研究结果相似，表明O₃造成大豆营养器官(叶片)氮代谢旺盛，光合产物输出率降低，最终影响籽粒产量的提高.这与郑有飞等^[34]的研究较为相似，他们认为100 nL ·L^-1 O₃熏气下大豆产量显著下降的主要原因是干物质生产速率下降； 而150 nL ·L^-1 O₃熏气下大豆产量显著下降，是由于干物质转移受抑制和干物质生产速率下降共同导致.鼓粒期东生1号叶片碳元素的增加，也证明除光合同化能力的降低外，O₃胁迫还可以通过减少光合产物向籽粒的输入降低谷类的收获指数^{[14, 35]}.

本研究测定指标涵盖生长发育、 产量与品质、 气体交换速率、 光合色素含量等指标，但研究周期仅为一个生长季，仅能在一定程度上反映O₃浓度升高对东北黑土区春大豆品种的影响.另外，试验采用OTC的熏蒸方式，气室内部环境条件与自然环境有一定差别，存在一定局限性.因此在今后的研究中，将考虑到O₃暴露浓度、 时间、 品种、 叶龄、 植物营养状态以及与其它环境因子之间交互作用的影响，以期全面评价东北黑土区春大豆品种的O₃敏感性，指导预防和减轻因O₃胁迫给春大豆生产带来的负面影响.

(1)O₃胁迫(日平均浓度58.6 nL ·L^-1，从开花初期至鼓粒后期，有效熏气天数68 d)导致东生1号大豆品种单株产量与籽粒百粒重显著低于过滤大气与自然大气处理，但株高、 主茎节数、 单株荚数与每荚粒数无显著变化.

(2)O₃胁迫显著降低盛花期大豆叶片净光合速率、 气孔导度、 水分利用效率、 开放的光系统反应中心激发能捕获效率与光系统Ⅱ的实际量子效率显著降低，净光合速率与电子传递效率的降低是减产的主要原因.

(3)O₃胁迫显著升高鼓粒期大豆叶片C与N元素含量，降低了碳氮比，使籽粒中N元素含量呈现升高趋势.