环境科学  2014, Vol. 35 Issue (4): 1468-1472   PDF    
引用本文
王娓敏, 邓玙, 邹华, 梁婵娟. 微囊藻毒素对水稻根系生长和抗氧化系统的影响[J]. 环境科学, 2014, 35(4): 1468-1472.
WANG Wei-min, DENG Yu, ZOU Hua, LIANG Chan-juan. Effects of Microcystins on Growth and Antioxidant System of Rice Roots[J]. Environmental Science, 2014, 35(4): 1468-1472.
微囊藻毒素对水稻根系生长和抗氧化系统的影响
王娓敏 , 邓玙, 邹华, 梁婵娟     
江南大学环境与土木工程学院,无锡 214122
收稿日期: 2013-8-26; 修订日期: 2013-10-10.
基金项目： 国家自然科学基金项目（31370517，31000245）；江苏省自然科学基金项目（BK2011161）
作者简介：王娓敏(1988~),女,硕士研究生,主要研究方向为环境生态学,E-mail: wwm523@sina.com
通讯联系人,E-mail:王娓敏(1988~),女,硕士研究生,主要研究方向为环境生态学,E-mail: wwm523@sina.com梁婵娟liangchanjuan@jiangnan.edu.cn
摘要：以水稻幼苗为材料，研究了不同质量浓度（1、100、1000、3000 μg·L-1）微囊藻毒素（MCs）在胁迫期和恢复期对水稻幼苗根系生长、吸收活力、抗氧化系统的影响以及MCs在水稻根部的积累.结果表明，胁迫处理7 d，MCs在水稻根部的积累量与MCs质量浓度呈正相关.1 μg·L-1 MCs处理促进了根系生长，根系活力上升，过氧化氢酶（CAT）活性上升有效维持H2O2于正常水平；100 μg·L-1 MCs处理下，根系生长受抑，根系活力下降，CAT无显著变化；在高质量浓度（1000 μg·L-1、3000 μg·L-1）MCs处理下，不仅根系生长受抑、根系活力下降，且CAT活性受抑，H2O2大量积累，膜质过氧化加剧.相比胁迫期，恢复7 d后各处理组水稻根系MCs的积累量均低于胁迫期.100 μg·L-1 MCs处理组根系各生长指标、根系活力、丙二醛（MDA）、H2O2和CAT的变幅减小，优于胁迫期，显示出一定程度的恢复，而1000 μg·L-1和3000 μg·L-1 MCs处理组，根系生长与根系活力均低于胁迫期，氧化胁迫进一步加剧，表明高质量浓度（1000 μg·L-1和3000 μg·L-1）MCs对水稻根系造成的伤害不可逆.
关键词： 微囊藻毒素     水稻     过氧化氢酶     生长     根系活力    
Effects of Microcystins on Growth and Antioxidant System of Rice Roots
WANG Wei-min , DENG Yu, ZOU Hua, LIANG Chan-juan    
School of Environment and Civil Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China
Abstract: The effect of different concentrations (1, 100, 1000 and 3000 μg·L-1) of microcystins (MCs) on growth, absorb activity, antioxidant system and its accumulation in roots of rice seedlings were studied. The results show that MCs accumulation was positively correlated with MCs concentration. After the treatment with 1 μg·L-1MCs, the root growth and activity increased. Meanwhile, catalase (CAT) activity was increased to maintain H2O2 at normal levels. After the treatment with 100 μg·L-1 MCs, the root growth and activity were inhibited whereas CAT had no obvious change. High concentrations (1000 μg·L-1 and 3000 μg·L-1) of MCs not only inhibited root growth and activity, but decreased CAT activity, leading to excessive H2O2 accumulation and membrane peroxidation. After a 7-day recovery, MCs accumulations in roots in all treatment groups were all lower than those measured during the stress period. For the 100 μg·L-1 MCs treated group, the inhibition on root growth and root activity, and membrane peroxidation were alleviated, better than those measured during the stress period. However, for 1000 μg·L-1 and 3000 μg·L-1 MCs treated groups, inhibition on root growth, root activity, and CAT activity were heavier than those during the stress period, and oxidation stress intensified further, indicating that the damage caused by high concentrations (1000 μg·L-1 and 3000 μg·L-1) of MCs on rice roots was irreversible.
Key words: microcystins     rice     catalase     growth     root activity    

水体富营养化日益加剧导致蓝藻水华频繁发生，水华藻类释放的不同类型毒素对生物有毒害作用，甚至引起毒性死亡，并有可能通过食物链威胁人类健康．其中，微囊藻毒素(microcystins, MCs)是蓝藻水华中出现频率最高、 产量最大和危害最严重的藻毒素[1]．世界卫生组织(WHO)规定水体中MCs的最大安全剂量为1 μg ·L-1，然而自然界水体中MCs含量通常在0.1~100 μg ·L-1内，当藻类大量死亡时MCs在短时间内可高达1 800 μg ·L-1 [2,3]．此外，MCs具有生物积累效应，能够在水生植物、 浮游动物、 鱼类和贝类等水产品中富集，具有沿食物链传递的风险，因此，关于MCs对水生生物的影响研究较多[4, 5]．然而，MCs也有可能通过灌溉进入农田生态系统，尤其是MCs能够抑制芥菜幼苗生长的首次报道后[6]， MCs对农作物生长、 农产品产量和质量的影响也受到关注．研究发现，MCs不仅抑制油菜、 菠菜和生菜等可食性植物的生长，还可以在体内富集[7,8,9]．另外，Chen等[10]发现MCs不仅可被植物吸收并在其体内积累，且能抑制植物体内保护酶的活性．然而，大部分研究都集中在不同浓度或不同暴露时间MCs对农作物氧化胁迫以及在农作物体内富集的影响，却鲜有关于水体中MCs浓度发生变化(如阶段性暴发、 湖泊底泥或农田土壤吸附MCs)时对农作物的影响．根系是植物吸收和运输生长所需水分和营养物质的重要器官，也是与MCs直接接触的器官．鉴于此，本实验以粮食作物水稻作为研究试材，分析胁迫期和恢复期(无MCs胁迫)内MCs对水稻幼苗根系生长、 生理生化的影响以及其在幼苗根部的积累，以期为客观评价灌溉水中的MCs对农作物生长的影响以及正确预测MCs进入食物链的安全风险提供基础信息．

1 材料与方法 1.1 藻毒素的制备

称取1 g干燥的藻粉，加入40 mL 5%的冰乙酸，室温抽提2 h， 8 000 r ·min-1离心10 min，沉淀用40 mL 5%冰乙酸继续搅拌抽提，重复2次，合并3次抽提的上清液，将粗提取液过Sep-pak C18柱(500 mg/6 mL, Waters corporation, 美国)，富集步骤如下：10 mL甲醇(100%)润洗，10 mL纯水润洗，进样，10 mL甲醇(100%)洗脱，旋转蒸发，收集MCs溶于1 mL纯水．采用高效液相色谱法(ultimate 3000, Dionex corporation,美国)确定MCs的含量，紫外可见光检测器波长：238 nm，色谱柱温度：40℃，流动相为甲醇和pH=3的磷酸盐缓冲液(二者的体积比为57 ∶43)，柱流速：1 mL ·min-1 [11]．

1.2 试材培养

供试水稻(Oryza sativa)为“淮稻8号”．挑选籽粒饱满的种子，0.1% HgCl2消毒10 min，然后用去离子水冲洗3次，去离子水浸泡24 h后置于25℃恒温光照培养箱中催芽4 d，将幼芽放在蛭石里培养20 d即幼苗长至2叶1心期时移入周转箱(6.88 L)中进行水培，营养液采用国际水稻研究所(IRRI)常规营养液配方，并略作修改[12]．光照强度为300 μE ·(m ·s)-2，光照12 h，昼/夜温度为30℃/24℃，相对湿度为60%．营养液每隔3 d换1次，待幼苗长至4叶1心期时，选长势一致的水稻幼苗进行MCs胁迫处理．

1.3 实验设计

将高浓度的MCs母液用营养液分别稀释成不同浓度梯度，选取4个MCs浓度(1、 100、 1 000、 3 000 μg ·L-1)，以不含MCs的营养液作为对照(CK)，每个处理3次重复．在处理7 d后进行各指标的测定，然后将处理过的植株在对照组培养条件下恢复培养7 d，再取样测定．

1.4 指标测定 1.4.1 水稻幼苗根部MCs含量的测定

处理第7 d和恢复7 d时取水稻幼苗根部组织，用去离子水洗涤4次以除去根部表面的MCs，然后用吸水纸吸干表面水分，称取0.5 g根部组织用2 mL 80%的甲醇研磨然后超声破碎，离心10 min．富集步骤参考1.1节进行，最后利用试剂盒(Beacon Analytical Systems Inc.,美国)采用酶联免疫法确定MCs的总含量．

1.4.2 根系生长指标的测定

以单株为单位，选取各处理组中长势一致的水稻幼苗，取其根部组织，用去离子水洗涤3次后于电热恒温干燥箱中100℃杀青10 min，80℃烘12 h至恒重，称其干重； 水稻根系指标(根长，根表面积，根体积)则运用WinRHZO (Pro 2009)根系图像分析系统软件进行测定[13]．

1.4.3 生理生化指标的测定

根系活力采用氯化三苯基四氮唑(TTC)脱氢酶法，丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法测定，过氧化氢(H2 O2)含量采用硫酸钛法测定，过氧化氢酶(CAT)活性采用高锰酸钾滴定法测定[14]．

每个处理组重复3次，每次测定重复3次，所有数据均为3次独立实验的平均值±标准误差(Mean±SD)，所有数据采用SPSS 16.0软件进行差异显著性分析，选择最小显著差法(LSD)进行多重比较．

2 结果与分析 2.1 MCs在水稻根部的积累

由图 1可知，MCs(1、 100、 1 000、 3 000 μg ·L-1)胁迫处理7 d后，MCs在水稻根部的积累量分别为20.6、 219.2、 225.4、 287.2 μg ·mg-1，呈明显的剂量-效应关系(相关性系数R2=0.685**)．当MCs浓度为3 000 μg ·L-1时，水稻根部的MCs含量最高，分别是1、 100、 1 000 μg ·L-1处理组的13.94、 1.31、 1.27倍．恢复期内，MCs在根部的富集量依然与处理浓度呈正相关(相关系数R2=0.611*)，但均小于相应处理在胁迫期时的富集量．

不同字母表示各处理间差异显著(P<0.05)，小(大)写字母分别表示胁迫期(恢复期)差异显著性，下同
图 1 MCs在水稻幼苗根部的积累Fig. 1 MCs accumulation in root of rice seedlings
2.2 MCs对水稻根系生长的影响

由表 1可知，胁迫期内，当MCs浓度为1 μg ·L-1时，根长、 根体积和根干重均上升，上升幅度分别为5.47%、 8.39%和14.29%； 根表面积下降，降幅为6.30%．在浓度1 000 μg ·L-1和3 000 μg ·L-1 MCs处理下，根长、 根表面积、 根体积和根干重明显下降，降幅分别为23.20%和28.53%、 23.48%和26.00%、 10.96%和12.82%、 36.73%和44.90%．恢复期内，根系指标在浓度1 μg ·L-1和100 μg ·L-1 MCs处理下均大于胁迫期，而在高浓度MCs (≥1 000 μg ·L-1)处理下，水稻根系指标仍然降低且均低于胁迫期．

表 1 MCs对水稻幼苗根系生长的影响1)Table 1 Effects of MCs on root growth of rice seedlings
2.3 MCs对水稻根系活力的影响

由图 2可知，胁迫期内，根系活力呈现“低促高抑”现象，当MCs浓度为1 μg ·L-1时，根系活力上升4.36%，当MCs浓度≥100 μg ·L-1时，根系活力下降，降幅分别为43.98%、 70.76%和87.47%．恢复期内，当MCs浓度为1 μg ·L-1时，根系活力增加，且大于胁迫期．当MCs浓度为100 μg ·L-1时，根系活力虽然低于CK但高于胁迫期，可见水稻根系活力有一定程度的缓解，但在高浓度(≥1 000 μg ·L-1)MCs的处理下，水稻根系活力仍然降低且均低于胁迫期，伤害不可逆．

图 2 MCs对水稻幼苗根系活力的影响Fig. 2 Effects of MCs on root activity of rice seedlings
2.4 MCs对水稻根系抗氧化系统的影响

由表 2可知，胁迫期内，当MCs浓度为1 μg ·L-1时，MDA含量和H2 O2含量没有显著变化，而CAT活性则显著上升(P<0.05)，当MCs浓度为100 μg ·L-1时，CAT活性未发生显著变化，但MDA含量和H2 O2含量则上升．在高浓度1 000 μg ·L-1和3 000 μg ·L-1 MCs处理下，MDA、 H2 O2含量上升(P<0.05)，且上升的幅度分别为32.95%和52.94%、 76.25% 和131.88%，而CAT活性则明显下降，降幅分别为48.12%和59.37%．恢复期内，MDA含量和H2 O2含量均呈现先下降后上升的趋势，而CAT活性则呈现先上升后下降的趋势．在100 μg ·L-1 MCs处理下，MDA、 H2 O2含量和CAT活性均可恢复到正常水平，在高浓度(≥1 000 μg ·L-1) MCs处理下，H2 O2含量低于胁迫期，而MDA含量则高于胁迫期，CAT活性则依然降低，且低于胁迫期．

表 2 MCs对水稻幼苗根系MDA、 H2 O2含量及CAT活性的影响 Table 2 Effects of MCs on MDA contents, H2 O2 contents and CAT activity of roots in rice seedlings
3 讨论 3.1 MCs在水稻根部的积累 MCs可以在不同植物体内积累[15,16,17,18]，这也许就是MCs影响植物生长发育的最直接原因．本实验结果显示，MCs富集量与处理浓度(灌溉水中MCs浓度)呈显著正相关，MCs处理浓度越高，MCs的富集量就越大(图 1)，表明灌溉水中MCs污染程度越严重，经可食性植物传递的风险就越大．恢复处理7 d，MCs富集量依然与处理浓度呈正相关，富集量低于胁迫期的，这与恢复期的水稻生长较胁迫期更好(表 1)，使得单位鲜重MCs的含量降低抑或MCs转移至水稻幼苗其他部位(茎、 叶)有关[19,20]． 3.2 MCs对水稻根系的影响

植物根系起着吸收水分和各种营养物质的重要作用，因此，根系生长的好坏直接影响地上部分的生长和营养状况．MCs胁迫处理下，根长、 根体积、 根干重和根系活力均呈现“低促高抑”的现象．植物的生长主要依靠细胞的增大和数目的增加[21]，低浓度(1 μg ·L-1)的MCs可能刺激了植物根系细胞分裂促进了根系生长，根系活力上升，而高浓度MCs造成了根系生长受抑制，根系面积的减小导致根系活跃吸收面积降低，根系活力下降，最终影响植物对营养和水分的吸收，导致地上部生长受抑．Liu等[22]也发现低浓度(<10 μg ·L-1)MCs能够刺激油菜和白菜的生长而高浓度MCs则抑制生长．这种“低促高抑”现象启示人们：灌溉时通过稀释、 吸附等手段降低水体中MCs浓度可缓解MCs对植物造成的伤害．恢复期内，100 μg ·L-1 MCs处理下，根系伤害有一定缓解，而高浓度(≥1 000 μg ·L-1) MCs处理对水稻根系的伤害不可逆，这与MCs在水稻根部的高富集量有关(图 1)．MCs毒性来自于本身且在植物体内大部分不易被降解，而富集在水稻根部的MCs可能通过抑制蛋白磷酸酶1和2A的活性，从而对水稻根部产生影响[23]，另一方面也可能通过引发活性氧代谢失衡，细胞代谢紊乱，体现为根系生长受抑．

3.3 MCs对水稻抗氧化系统的影响

Peuthert等[20]发现浓度为5.0 μg ·L-1的MCs导致11种农作物的细胞发生氧化胁迫作用，这与MCs抑制抗氧化酶活性有关．笔者发现，当MCs浓度为1 μg ·L-1时，CAT活性能够有效维持H2 O2含量在正常水平(表 2)，可能原因是MCs胁迫引发水稻幼苗抗氧化系统的应激启动，CAT活性升高有效清除了部分的H2 O2，缓解了MCs胁迫，而在高浓度(≥1 000 μg ·L-1)MCs处理下，CAT活性受抑制，无法清除过量的H2 O2，膜脂过氧化发生．这和李慧明等[24]研究MCs对黑麦草生长、 生理生化影响的结果一致．高浓度MCs使抗氧化防御系统遭到破坏，无法清除体内过多的活性氧，氧化胁迫伤害发生，使得植物生长与生理代谢受抑．恢复期内，100 μg ·L-1 MCs处理组的MDA、 H2 O2含量和CAT活性均恢复到正常水平，而高浓度(≥1 000 μg ·L-1)MCs处理组的CAT活性不仅低于对照组，甚至低于胁迫期．结合MDA含量呈现相同规律可知，CAT活性无法恢复是促使膜质过氧化进一步恶化的主要原因．高浓度MCs作用致使大量的H2 O2积累，这不仅会直接引发膜脂过氧化，也可与CAT反应形成复合物，这种钝化形式抑制了CAT活性[25]．

4 结论

(1) MCs能被水稻吸收并富集，在植物体内造成膜脂过氧化，对水稻幼苗根系生长产生消极影响．

(2) 恢复实验结果表明，在浓度(≤100 μg ·L-1)MCs处理组根系生长、 根系活力、 CAT活性和膜质过氧化均有一定程度的恢复，高浓度(≥1 000 μg ·L-1)MCs处理组CAT活性进一步降低，膜脂过氧化加剧，根系受到的伤害不可逆．

(3) 低浓度MCs (1 μg ·L-1)促进植物生长，高浓度(≥1 000 μg ·L-1)MCs则会对植物造成不可逆伤害．在水体富营养化尚不能有效遏制的前提下，降低灌溉水MCs浓度可减轻MCs对农作物的伤害．

参考文献
[1] Hrudey S E, Peterson H G, Kenefick S L, et al. Toxin release from Microcystis aeruginosa after chemical treatment [J]. Water Science and Technology, 1993, 27 (3-4): 400-433.
[2] Lahti K, Rapala J, Färdig M, et al. Persistence of cyanobacterial hepatotoxin, microcystin-LR in particulate material and dissolved in lake water [J]. Water Research, 1997, 31 (5): 1005-1012.
[3] Jones G J, Orr P T. Release and degradation of microcystin following algicide treatment of a Microcystis aeruginosa bloom in a recreational lake, as determined by HPLC and protein phosphatase inhibition assay [J]. Water Research, 1994, 28 (4): 871-876.
[4] Ibelings B W, Chorus I. Accumulation of cyanobacterial toxins in freshwater "seafood" and its consequences for public health: A review [J]. Environmental Pollution, 2007, 150 (1): 177-192.
[5] Zhang D W, Xie P, Liu Y Q, et al. Spatial and temporal variations of microcystins in hepatopancreas of a freshwater snail from Lake Taihu [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2009, 72 (2): 466-472.
[6] Kós P, Gorzó G, Surányi G, et al. Simple and efficient method for isolation and measurement of cyanobacterial hepatotoxins by plant tests (Sinapis alba L.) [J]. Analytical Biochemistry, 1995, 225 (1): 49-53.
[7] Chen J Z, Song L R, Dai J, et al. Effects of microcystins on the growth and the activity of superoxide dismutase and peroxidase of rape (Brassica napus L.) and rice (Oryza sativa L.) [J]. Toxicon, 2004, 43 (4): 393-400.
[8] Pflugmacher S, Aulhorn M, Grimm B. Influence of a cyanobacterial crude extract containing microcystin-LR on the physiology and antioxidative defence systems of different spinach variants [J]. New Phytologist, 2007, 175 (3): 482-489.
[9] Crush J R, Briggs L R, Sprosen J M, et al. Effects of irrigation with lake water containing microcystins on microcystin content and growth of ryegrass, clover, rape, and lettuce [J]. Environmental Toxicology, 2008, 23 (2): 246-252.
[10] Chen J Z, Dai J, Zhang H Y, et al. Bioaccumulation of microcystin and its oxidative stress in the apple (Malus pumila) [J]. Ecotoxicology, 2010, 19 (4): 796-803.
[11] BG/T 20466-2006, 水中微囊藻毒素的测定[S].
[12] 狄廷均, 朱毅勇, 仇美华, 等. 水稻根系细胞膜H+-ATPase对铵硝营养的响应差异[J]. 中国水稻科学, 2007, 21 (4): 360-366.
[13] Sun Z G, Wang L H, Zhou Q, et al. Effects and mechanisms of the combined pollution of lanthanum and aicd rain on the root phenotype of soybean seedlings [J]. Chemosphere, 2013, 93 (2): 344-352.
[14] 张治安, 陈展宇. 植物生理学实验技术[M]. 长春: 吉林大学出版社, 2008. 60-61, 184-187, 192-193.
[15] Pflugmacher S, Wiegand C, Beattie K A, et al. Uptake, effects, and metabolism of cyanobacterial toxins in the emergent reed plant Phragmites australis (cav.) trin. ex steud [J]. Environmental Toxicology and Chemistry, 2001, 20 (4): 846-852.
[16] 薛延丰, 李慧明, 易能, 等. 微囊藻毒素(MC-RR)对白三叶种子萌发及幼苗生理生化特性影响[J]. 草业学报, 2009, 18 (6): 180-185.
[17] Mitrovic S M, Allis O, Furey A, et al. Bioaccumulation and harmful effects of microcystins-LR in the aquatic plants Lemna minor and Wolffia arrhiza and the filamentous alga Chladophora fracta [J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2005, 61 (3): 345-352.
[18] McElhiney J, Lawton L A, Leifert C. Investigations into the inhibitory effects of microcystins on plant growth, and the toxicity of plant tissues following exposure [J]. Toxicon, 2001, 39 (9): 1411-1420.
[19] Järvenpää S, Niinistö C L, Spoof L, et al. Effects of microcystins on broccoli and mustard, and analysis of accumulation toxin by liquid chromatography-maa spectrometry [J]. Toxicon, 2007, 49 (6): 865-874.
[20] Peuthert A, Chakrabarti S, Pflugmacher S. Uptake of microcystins-LR and –LF (cyanobacterial toxins) in seedlings of several important agricultural plant species and the correlation with cellular damage (lipid peroxidatin) [J]. Environmental Toxicology, 2007, 22 (4): 436-442.
[21] 宇克莉, 孟庆敏, 邹金华. 镉对玉米幼苗生长、叶绿素含量及细胞超微结构的影响[J]. 华北农学报, 2010, 25 (3): 118-123.
[22] Liu B B, Gong Y, Xiao B D, et al. A laboratory study on risk assessment of microcystin-RR in cropland [J]. Journal of Environmental Management, 2008, 86 (3): 566-574.
[23] 尹黎燕. 微囊藻毒素对高等植物的生态生理学效应研究[D]. 武汉: 中国科学院水生生物研究所, 2005. 1-13.
[24] 李慧明, 干晓宇, 邓蕾, 等. 微囊藻毒素(MC-LR)在黑麦草幼苗体内的积累及对其生长的影响[J]. 农业环境科学学报, 2010, 29 (1): 49-53.
[25] 胡国霞. PEG预处理对水分胁迫下水稻抗氧化系统的影响[D]. 沈阳: 沈阳师范大学, 2011. 27-43.