环境科学  2014, Vol. 35 Issue (4): 1457-1461   PDF    
引用本文
陈善佳, 陈秀荣, 闫龙, 赵建国, 章斐, 江子建. 毒性有机物BPA与普通小球藻的相互影响特性研究[J]. 环境科学, 2014, 35(4): 1457-1461.
CHEN Shan-jia, CHEN Xiu-rong, YAN Long, ZHAO Jian-guo, ZHANG Fei, JIANG Zi-jian. Research on Characteristic of Interrelationship Between Toxic Organic Compound BPA and Chlorella vulgaris[J]. Environmental Science, 2014, 35(4): 1457-1461.
毒性有机物BPA与普通小球藻的相互影响特性研究
陈善佳, 陈秀荣 , 闫龙, 赵建国, 章斐, 江子建    
华东理工大学资源与环境工程学院,上海 200237
收稿日期: 2013-8-12; 修订日期: 2013-9-28.
基金项目： 上海市浦江人才计划项目（13PJD009）；国家自然科学基金项目（51008124，51378207）；国家杰出青年科学基金项目（51125032）
作者简介：陈善佳(1989~),男,硕士研究生,主要研究方向为水污染控制工程,E-mail:csj489@163.com
通讯联系人,E-mail:陈善佳(1989~),男,硕士研究生,主要研究方向为水污染控制工程,E-mail:csj489@163.com陈秀荣xrchen@ecust.edu.cn
摘要：考察了不同浓度双酚A（BPA）对普通小球藻（Chlorella vulgaris）生长特性的影响，以及普通小球藻生长过程对BPA的去除效能.研究表明，低浓度BPA（0~20 mg·L-1）对普通小球藻生长具有促进作用，而高浓度BPA（20~50 mg·L-1）对普通小球藻生长具有抑制作用，且抑制效应与BPA浓度呈正相关关系.低剂量BPA（<20 mg·L-1）对叶绿素含量并无明显的影响，高剂量BPA（>20 mg·L-1）造成叶绿素含量降低.在BPA初始浓度2~50 mg·L-1的范围内，普通小球藻对其都有一定的去除效能，单位普通小球藻对BPA去除速率与其初始浓度呈正相关关系.BPA投加量为50 mg·L-1时，BPA去除速率最大，且最大速率出现于延滞期与对数期之间.
关键词： 普通小球藻     双酚A（BPA）     细胞密度     叶绿素a     抑制或促进    
Research on Characteristic of Interrelationship Between Toxic Organic Compound BPA and Chlorella vulgaris
CHEN Shan-jia, CHEN Xiu-rong , YAN Long, ZHAO Jian-guo, ZHANG Fei, JIANG Zi-jian    
College of Resources and Environmental Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China
Abstract: The effects of different concentrations of bisphenol A (BPA) on Chlorella vulgaris and removal capacity of BPA by Chlorella vulgaris were investigated. Results showed that a low concentration (0-20 mg·L-1) of BPA promoted the growth of Chlorella vulgaris, whereas a relative high concentration (20-50 mg·L-1) of BPA inhibited the growth of Chlorella vulgaris, and the inhibition effect was positively correlated with the concentration of BPA. Likewise, a high dose of initial BPA (>20 mg·L-1) led to a decline in the content of chlorephyll a. Chlorella vulgaris had BPA removal capacity when initial BPA concentration ranged from 2 mg·L-1 to 50 mg·L-1. There was positive correlation between the removal rate of BPA per cell and initial BPA concentration. The removal rate of BPA was the highest when initial BPA was 50 mg·L-1, which appeared between lag phase and logarithmic phase.
Key words: Chlorella vulgaris     bisphenol A     cell density     chlorophyll a     promotion or inhibition    

微藻作为初级生产力，对自然界物质循环的重要性不言而喻.微藻具有生物量大、 生长速率快、 收获时期短、 光合利用效率高等特点，是目前最有希望替代化石能源的原料之一[1,2,3].同时，微藻生长过程中会吸收大量氮、 磷，可用于污水脱氮除磷[4,5,6].普通小球藻是对有机污染物耐受力最强的8种藻类之一[7]，因此利用普通小球藻去除毒性有机污染物常见报道[8, 9].在小球藻对有机污染物去除的过程中，也可借助小球藻灵敏的生长特性变化来反映目标污染物的毒性[10]，进而综合评估目标污染物的环境风险.据此，本研究选择BPA为目标污染物，考察小球藻对BPA去除效能及BPA对小球藻生长特性的影响.BPA作为环氧树脂等工业原料的前体物质[11]，是最常见的内分泌干扰物之一[12]，世界范围内其产量高达270万t[13].环境中BPA的一个重要来源是聚碳酸酯(PC)塑料瓶[14]，其有可能在水体或其他环境中与小球藻等水生生物广泛接触，对水生生物的急性毒性以及雌激素干扰作用[15]一直以来备受关注，故选择BPA作为目标污染物研究其与普通小球藻相互影响具有一定的现实意义.

1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂

实验藻种为普通小球藻(Chlorella vulgaris, FACHB-31)，购自中国科学院武汉水生生物研究所.实验中所用双酚A购自阿拉丁试剂. 1.2 主要设备与仪器

主要仪器包括博迅光照培养箱SPX-250B-G，MOTIC光学显微镜BA200，海尔冰箱BCD-208，Techcomp分光光度计UV1102，岛津高效液相色谱 HITACHI L2000(配L-2450二极管整列检测器和L2200自动进样器)，博迅不锈钢手提式压力蒸气灭菌器YXQ-LS-18SI，六联磁力搅拌器HJ-6，博迅洁净工作台VS840-1，卢湘离心机TDZ5-WS. 1.3 实验方法

普通小球藻采用BG-11培养基光自养培养，温度25℃，光暗比14 ∶10，光照度为2000 lx.培养12 d.设置5组实验，BPA浓度分别为2、 5、 10、 20、 50 mg ·L-1，每组3个平行样.0、 40、 88、 136、 208、 256 h各取样一次.测定细胞密度、 叶绿素以及双酚A含量.测定指标如表 1所示.

表 1 实验过程中分析测定方法 Table 1 Analytical methods in the experiment
2 结果与讨论

为了考察BPA与小球藻的相互影响过程，从毒性环境培养过程中普通小球藻的生长指标与BPA的去除效果出发，分别测定了普通小球藻细胞密度和叶绿素，以及培养基中双酚A的含量变化.

2.1 不同浓度BPA对普通小球藻生长特性的影响 2.1.1 不同浓度BPA对普通小球藻细胞密度增长的影响

实验藻液为在BG-11培养基中光自养培养的普通小球藻藻液，在实验对数期，取密度为5×107 mL-1藻液10 mL接种于100 mL BG-11培养基中，培养12 d.培养周期中细胞密度如图 1所示，表明BPA初始浓度在0~50 mg ·L-1各梯度时，藻细胞密度随时间而增长的过程.

图 1 不同BPA初始浓度时小球藻细胞密度增长 Fig. 1 Increment of Chlorella vulgaris cell density at different initial BPA concentrations

由图 1可知，小球藻延滞期出现在0~50 h之间，且空白组与实验组并无明显差异，而Gao等[16]在对小球藻暴露于壬基苯酚的研究表明，小球藻的生长延滞期有明显滞后.在本研究中，BPA对小球藻的毒性作用并未表现为延长延滞期，在0~50 mg ·L-1浓度范围内，小球藻能较快适应毒性环境进入对数期.鉴于文献结论与本研究结论的差异，认为是与毒性物质的作用机制不同有关.小球藻细胞在50 h左右的适应后，开始对数增长.在150~250 h时段内，各组细胞数均增长达到峰值，其中空白组峰值为23.38×106 mL-1，而最大峰值在5 mg ·L-1 BPA一组中出现，其峰值达到38.25×106 mL-1，最小峰值在50 mg ·L-1组出现(7.58×106mL-1).结果表明，50 mg ·L-1的BPA初始浓度对普通小球藻细胞密度增长呈现显著的抑制效应，培养过程中，其细胞密度显著低于空白组.而BPA初始浓度小于20 mg ·L-1的3个组则表现出对小球藻生长的促进作用，尤其在150 h后促进作用更加明显，藻细胞密度的峰值(33.25×106、 38.25×106和35.92×106 mL-1)也显著高于空白组(23.38×106 mL-1). Gulnaz等[17]和Takashi等[18]研究指出，当BPA浓度超过20 mg ·L-1会抑制普通小球藻生长.BPA等内分泌干扰物普遍存在剂量效应，南京大学卫立等[19]研究表明，低剂量BPA对MCF2细胞增殖作用产生倒U型非单调剂量效应关系，在低浓度的上升期表现出类雌激素效应，高浓度的下降期表现出细胞毒性作用.方堃[20]研究表明，微藻对低剂量的PCBs有一定耐受力，且低剂量的PCBs对藻的生长有轻微的刺激作用.从本研究中BPA对普通小球藻的作用效果来看，低浓度BPA(低于20 mg ·L-1)对普通小球藻的增殖也有促进作用，而在高浓度(高于20 mg ·L-1)则表现出明显的毒性效应.

2.1.2 不同浓度BPA对普通小球藻细胞生长速率的影响

为表征普通小球藻生长活性受不同浓度BPA的影响，实验考察了不同初始浓度BPA对普通小球藻生长速率的影响，实验结果如图 2所示.

图 2 投加不同浓度BPA对普通小球藻生长速率的影响Fig. 2 Effects of BPA concentrations on growth rate of Chlorella vulgaris

由图 2可知，在整个培养过程中，空白组小球藻细胞数增长速率从0~40 h的-2.92×103 (mL ·h)-1提高到136~208 h的143.75×103 (mL ·h)-1，此后开始下降到208~256 h的97.22×103 (mL ·h)-1.当培养基中投加BPA后，小球藻增长速率受到了显著影响.总体而言，如图 1中所示，增长速率还是遵循0~208 h阶段上升，208~256 h下降的规律.在对数生长阶段的136~208 h期间，BPA初始浓度分别为2、 5、 10、 20 mg ·L-1[分别达到288.19×103、 346.99×103、 366.20×103和205.32×103 (mL ·h)-1]各组的增长率都明显高于空白组[143.75×103 (mL ·h)-1].这表明，0~20 mg ·L-1 浓度范围的BPA对于小球藻对数期的增长速率有促进作用； 而对于50 mg ·L-1的BPA浓度而言，小球藻生长速率在整个培养过程中都受到了抑制，5个阶段生长率分别为-5.00×103、 20.83×103、 23.96×103、 27.66×103和2.95×103 (mL ·h)-1，全程低于空白组，且没有出现明显的对数增长期.各组小球藻增长率峰值[143.75×103、 288.19×103、 346.99×103、 366.20×103、 205.32×103和27.66×103 (mL ·h)-1]都出现在136~208 h； 经过增长率峰值后，BPA初始浓度为2、 5、 10 mg ·L-1的3组小球藻细胞在208~256 h阶段出现衰减[分别为-111.11×103、 -19.10×103和-180.56×103 (mL ·h)-1]，表明其已进入衰亡期，其余组生长率均大于0.李睿等[11]研究表明，4~6 mg ·L-1双酚A 会导致微小小环藻的增长减慢，生长周期延长； 而8~10 mg ·L-1双酚A对藻细胞生长产生明显抑制作用.结合本实验结果可知，低剂量BPA的存在也会导致普通小球藻衰亡期的提前出现.

2.1.3 不同浓度BPA对普通小球藻细胞叶绿素含量的影响

普通小球藻细胞内叶绿素含量变化可从细胞质量特性方面表征小球藻生长状况，如图 3所示.

图 3 不同浓度BPA对普通小球藻培养过程叶绿素含量的影响Fig. 3 Effects of BPA concentrations on Chlorophyll a contents of Chlorella vulgaris

由图 3可知，在0~256 h内，空白组小球藻细胞内叶绿素含量呈持续上升趋势，叶绿素含量峰值出现在256 h(8.85 mg ·L-1)，整个培养过程中未见叶绿素有下降现象.结合图 2和图 3可知，叶绿素含量变化与藻细胞密度变化趋势一致，区别在于藻细胞增长曲线有明显拐点，出现于208 h左右，而叶绿素含量呈持续上升.这说明，叶绿素合成与藻细胞分裂过程存在不同步现象.究其原因，可能是开始阶段较低的叶绿素a积累足以满足小球藻的光合作用所需，但随着藻密度的增加，细胞之间遮光效果趋于严重，致使一部分藻细胞捕捉光能、 转换光能的效率降低，从而影响了细胞数的增加，而光照条件不足情况下，藻细胞则会采取提高叶绿素含量来提高光的利用率[21]. Li等[22]研究表明，低浓度BPA(低于1 mg ·L-1)对冠盘藻的叶绿素抑制不明显，高浓度BPA会导致其叶绿素含量降低.本研究中BPA初始浓度为20 mg ·L-1与50 mg ·L-1对小球藻细胞叶绿素含量呈显著抑制作用； 而BPA初始浓度2、 5 和10 mg ·L-1对叶绿素含量并无明显抑制，至培养末期，5 mg ·L-1 BPA组的小球藻细胞叶绿素含量出现最高值(9.19 mg ·L-1).

2.2 普通小球藻对不同浓度BPA的去除情况

在小球藻培养过程中，为了评价小球藻对BPA的去除效能，考察了不同初始浓度BPA的培养过程中，小球藻对BPA的去除效果.普通小球藻的培养过程中，BPA浓度的变化如表 2所示.投加不同浓度BPA后，普通小球藻均对其有不同程度的去除效能.随BPA投加浓度增大，水相BPA损失量也越大. 2 mg ·L-1投加量下，BPA浓度从2 mg ·L-1降至0.76 mg ·L-1； 而当初始BPA投加量增至50 mg ·L-1，最终水相中BPA浓度为34.21 mg ·L-1，BPA去除量为17.79 mg ·L-1.对于小球藻去除BPA的效能，可以利用单位藻细胞对BPA的去除速率来反映.

表 2 BPA浓度随时间的变化1)/mg ·L-1 Table 2 BPA concentrations at different time points/mg ·L-1

如图 4所示，随着BPA初始投加量的提高，单位普通小球藻对BPA的去除速率提高，在50 mg ·L-1初始投加量阶段去除率达到最大，即在不同初始BPA投加量的情况下，普通小球藻对BPA的去除速率与BPA初始投加量呈正相关关系(r>0.95，P<0.01).2、 5、 10、 20 和50 mg ·L-1初始BPA投加量下，BPA去除速率最大的时间阶段均为40~88 h，分别达到14.67×10-10、 26.47×10-10、 51.44×10-10、 100.67×10-10和308.98×10-10 mg ·(cell ·h)-1.在这个阶段，正是生长延滞期结束，小球藻适应培养基环境，增长速率大幅提高的阶段，但并非增长速率最大(136~208 h)阶段.

图 4 不同时间内单位藻细胞BPA去除速率 Fig. 4 Removal rate per cell in different phases

在生长速率最高的136~208 h阶段和最大降解速率的40~88 h阶段，不同BPA初始投加浓度下，生长速率与BPA去除速率之间的关系如图 5所示. 从中可知，在生长速率最大的阶段(136~208 h)，普通小球藻对不同初始投加浓度BPA的去除速率全程低于40~88 h阶段，即延滞期到对数期的过渡阶段.因此，结合图 4可知，本实验中BPA最大去除速率与小球藻生长速率存在不同步现象.分析认为，在过渡阶段，普通小球藻适应了BPA存在的环境，因此加快了BPA的去除速率，迟杰等[23]对普通小球藻降解邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)的研究表明，普通小球藻对DEHP的降解速率最快阶段是在延滞期和对数期之间，这与本研究结果一致.另外，微藻对BPA的去除途径包括吸附、 胞内降解[24]、 胞外降解(胞外降解的一种途径是通过藻细胞分泌物使环境中生成 ·OH达到去除污染物的目的[25])等.在不同生长阶段，BPA的去除机制也有差异，故本研究中出现了BPA去除速率与生长速率不同步现象.关于不同步现象发生的确切原因，尚待后续实验深入研究.

图 5 不同BPA初始投加量对BPA去除率与小球藻生长速率影响比较Fig. 5 Comparison of effects on BPA removal rate and Chlorella vulgaris growth rate at different initial BPA concentrations
3 结论

(1) 在含有BPA的培养基环境下，普通小球藻生长可被抑制也可被促进，决定因素在于BPA投加浓度.培养基环境中BPA浓度高于20 mg ·L-1时，即表现出对普通小球藻生长的抑制，低于20 mg ·L-1表现为促进作用.

(2) 叶绿素含量变化与藻细胞密度变化趋势基本一致，区别在于藻细胞增长曲线有明显拐点，而叶绿素含量变化没有.低剂量BPA(<20 mg ·L-1)对叶绿素含量并无明显的影响，高剂量BPA(>20 mg ·L-1)造成叶绿素含量降低.

(3) 普通小球藻对BPA表现出一定的去除效能，对比投加的各浓度梯度的BPA，单位普通小球藻对BPA去除速率与BPA初始浓度呈正相关关系(r>0.95, P<0.01)，BPA投加浓度为50 mg ·L-1时，去除速率最大.普通小球藻对BPA的去除速率最大的阶段在于延滞期到对数期之间.

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