2014, Vol. 35
2. 工业聚集区污染控制与生态修复教育部重点实验室,广州 510006;
3. 广东省水与大气污染防治重点实验室,广州 510655
, DANG Zhi1,2, WU Feng-ji1, LIANG Xu-jun1, GUO Chu-ling1,2
, LU Gui-ning1,3, YANG Chen1,2
2. The Key Laboratory of Pollution Control and Ecosystem Restoration in Industry Clusters, Ministry of Education, Guangzhou 510006, China;
3. The Key Laboratory of Water and Air Pollution Control of Guangdong Province, Guangzhou 510655, China
多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons， PAHs)是一大类广泛存在于环境中的有机污染物，也是一类潜在的化学致癌物[1, 2].已有的研究报道表明,微生物降解是去除环境中多环芳烃的最主要途径[3, 4].微生物降解的研究重点目前更多集中在污染物降解和降解效率等方面，而降解菌自身的变化主要采用细胞干重法、 培养体系浊度测量(吸光度)等传统方法来反映.但是这类方法通常只是从宏观的角度了解降解过程中微生物的生长状况，无法反映降解过程中微生物个体细胞的变化特征[5].微生物个体细胞的生理状态、 代谢功能及繁殖能力，对于污染物降解过程的效果有着决定性的作用[6].因此，对降解过程中细菌个体细胞的状态进行研究能更好地了解微生物的降解机制，从而充分发挥微生物的降解能力.
在降解过程中，微生物与污染物的接触是其进行降解的第一步[7]，污染物对细菌细胞壁及质膜的作用会改变微生物的疏水性、 质膜通透性及表面ζ 电位等，进而影响细菌的降解功能. Ramos等[8]报道当有机溶剂的 lgKow在 1.5~3之间时，会改变细菌细胞膜的脂肪酸成分，破坏细胞膜的结构和通透性，从而导致细菌的溶解和死亡. Baumgarten等[9]发现 Pseudomonad putida DOT-T1E在1-癸醇 为碳源的条件下，其ζ电位及水相接触角发生变化，导致疏水性增强，使其形成生物膜，从而能更好地适应生长环境的改变.Wick等[10]的研究表明当以固态蒽(anthracene)为唯一碳源时，菌株表面疏水性及所带负电荷程度较以葡萄糖为碳源培养条件下更高，这促进了LB501T菌对固态蒽的降解.因此，探究降解过程中污染物对菌体细胞表面性质的影响，有助于了解微生物对污染物的适应机制，促进污染物的降解.
常用的检测细胞质膜通透性的方法有 β-半乳糖苷酶(ONPG)诱导法、 硝酸镧(La)示踪法、 LDH释放法和电导率检测方法等[11, 12]，但这些方法存在着灵敏度和精确性不高或操作繁琐等缺点.流式细胞术(FCM)因其快速准确的单细胞分析能力，近年来逐渐被应用到微生物领域.相对于传统方法的宏观测量，流式细胞术与各种荧光染料结合能更好地从微观角度了解细菌的单细胞状态，如检测细胞周期变化、 细胞数量及其群体结构变化[13~16],其检测的标准主要是基于对于细胞完整性、 细胞生理功能不同程度变化的反应，可区分反应过程中的细胞状态(活细胞、 受损细胞和死亡细胞)[17, 18]. 本研究尝试结合流式细胞术与荧光染料检测高效菲降解菌GY2B(Sphingomonas sp. GY2B)降解菲过程中膜通透性的变化； 同时，分析细菌细胞表面疏水性及ζ电位的变化，探究污染物菲对其降解菌GY2B个体细胞及其的表面性质的影响，了解降解过程中污染物对降解菌的影响，以期为更好地进行污染环境的微生物修复提供理论依据.
实验菌种：鞘氨醇单胞菌 GY2B(Sphingomonas sp. GY2B，Genbank No.：DQ139343)，革兰氏阴性菌株，由本课题组从广州地区受 PAHs污染严重的土壤筛选得到[19].
菲贮备液：菲购自 Aldrich公司,纯度为 98%，用正己烷配置浓度为 1 g ·L-1、 5 g ·L-1和 10 g ·L-1浓度的贮备液, 4℃冰箱中保存备用.
无机盐基础培养液(MSM)[20]：5.0 mL ·L-1磷酸盐缓冲液(8.5 g ·L-1 KH2PO4，21.75 g ·L-1 K2HPO4 ·H2 O，33.4 g ·L-1 Na2HPO4 ·12H2 O，5.0 g ·L-1 NH4Cl)，3.0 mL ·L-1 MgSO4水溶液(22.5 g ·L-1)，1.0 mL ·L-1 CaCl2水溶液(36.4 g ·L-1)，1.0 mL ·L-1 FeCl3水溶液(0.25 g ·L-1)，1.0 mL ·L-1微量元素溶液[39.9 mg ·L-1 MnSO4 ·H2 O， 34.7 mg ·L-1 (NH4)6Mo7O24 ·4H2 O， 42.8 mg ·L-1 ZnSO4 ·H2 O]，pH 为7.2.
磷酸盐缓冲液(PBS)：56.78 g ·L-1 Na2HPO4， 48 g ·L-1 NaH2PO4， 8.77 g ·L-1 NaCl， pH=7.2， 0.22 μm滤膜过滤后灭菌4℃冰箱中保存备用.
碘化丙啶(PI)母液：PI染料购置于Sigma公司，用超纯水配制为浓度为0.4 mg ·mL-1的母液，4℃冰箱中保存备用.
1%多聚甲醛溶液：称取 1.0 g多聚甲醛至 100 mL PBS溶液中， pH调节至 7.2， 0.22 μm滤膜过滤后，4℃冰箱中避光保存备用. 1.2 实验方法 1.2.1 菌株 GY2B对菲的降解实验
向含有 1.2、 100及 300 mg ·L-1菲的体系中加入 1 mL培养至对数期 GY2B菌悬液，总反应体系为 50 mL，于 150 r ·min-1，30℃的摇床培养箱中恒温避光培养5 d.分别以灭菌含菲无机盐培养基和同等接种量细菌不含菲无机盐培养基作为空白对照. 1.2.2 菌体膜通透性(membrane permeability)的测定
本实验选用 PI荧光染料与流式细胞仪结合检测 GY2B菌细胞表面变化[17]，分别于以上反应体系开始和结束后收集 GY2B细胞. 8 000 r ·min-1，离心 5 min收集 GY2B细胞(细胞数量约为 5×106个 ·mL-1)，预冷PBS洗涤2次, 1%多聚甲醛固定于4℃保存待检测[21].
进行流式检测之前，固定的细胞需用预冷PBS洗涤2次去除固定剂，然后加入 PI染液使其终浓度为 50 μg ·mL-1， 37℃ 避光孵育 30 min,过 400目尼龙筛网后进行流式细胞仪(Beckman Coulter XCL-MCL)检测[21](激发光488 nm, FL3 检测器测605~635 nm发射光强度), 计数10 000个细胞. 1.2.3 菌体完整、 受损和死亡细胞的区分
本研究利用SYTO9/PI染料(LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit，Invitrogen)对所收集的细菌细胞进行染色，后利用流式细胞仪分析不同底物条件、 不同菲浓度条件下GY2B细菌细胞的死亡、 受损及活细胞的比例.
在6 000 r ·min-1，20℃条件下, 离心 10 min收集 GY2B菌体，预冷PBS洗涤两次后，重悬于1 mL PBS中，加入SYTO9/PI染液(3 μL,比例为1 ∶1)，室温下，避光孵育15 min，过 400目尼龙筛网后 上机检测[22].检测激发光为488 nm, SYTO9染料为 FL1检测通道， PI为 FL3 检测通道, 计数10 000个细胞以上. 1.2.4 傅里叶红外光谱检测(Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FI-RT)
6 000 r ·min-1，20℃条件下, 离心10 min收集菌体，PBS缓冲液洗涤3次，冷冻干燥24 h后进行检测[23].检测波段为4 000~600 cm-1. 1.2.5 菌体表面Zeta电位的测定
在6 000 r ·min-1，20℃条件下, 离心10 min收集菌体，用10 mmol ·L-1磷酸盐缓冲溶液洗涤，重悬于缓冲液，振荡使得菌悬液均匀，然后用 Zeta电位仪(马尔文NANO ZS90)测定 Zeta电位的变化； 同时检测离心后的上清液Zeta电位的变化[24].
碘化丙啶(propidium iodide，PI)作为一种核酸染料，可以进入死亡的细胞与DNA或RNA结合，但PI染料不能进入完整膜结构细胞，因而，研究中常用PI染料来区分死亡细胞及活细胞[25].但是， Vives-Rego等[17]进一步研究发现， PI染色的细胞并不全为死细胞，一些膜通透性改变及膜结构受损的细胞也可以染上PI荧光而被检测到. Shi等[26]的研究也发现， PI染色的 Sphingomonas sp. LB126菌株，大部分可在琼脂平板上再次生长.因此，利用 PI染料这一特性，对降解过程中细胞的膜通透性进行检测，可以了解细胞表面特性的变化.
本实验所用流式细胞仪为Beckman Coulter XCL-MCL型，其PI染料最佳检测通道为FL3通道，其各项检测参数如表 1所示.
 | 表 1 Beckman Coulter XCL-MCL流式细胞仪各项检测参数Table 1 Test parameters of Beckman Coulter XCL-MCL flow cytometer |
实验中，设置未染色细胞为阴性对照及70%异丙醇作用1 h的PI染色细胞为阳性对照，用以区分PI染色细胞与未染色细胞，如图 1. 其中图 1(a)为未染色细胞所在位置； 图 1(b)为死亡和受损细胞所在位置，此区域设置为B门，则实验中，处于B门中的细胞即为细胞膜通透性发生变化的细菌细胞.
 | 图 1 阴性及阳性对照Fig. 1 Negative control and positive control |
SYTO9作为一种绿色荧光核酸染料，其既可对完整膜结构细胞染色同时也可以染色膜受损细胞，通常被用于细菌细胞的计数.相反，PI染料则只能进入膜结构受损的细胞，当两者同时存在时， PI染料会削弱 SYTO9的荧光强度[27].利用两种染料的光谱特征及渗透健康细胞能力的不同，则可区分出死亡、 受损及完整的细菌细胞.
本实验中采用120℃高温作用的GY2B细菌细胞作为PI阳性对照，培养至对数期的GY2B细菌细胞作为SYTO9阳性对照， 未染色的细胞则作为阴性对照. 并依据阳性对照的不同位置，确定出死亡、 受损及完整细胞在流式图中所在的位置.结果如图 2所示.
 | 图 2 阴性对照及阳性对照 Fig. 2 Negative control and positive control |
利用平板计数法对 1.2、 100及 300 mg ·L-1的菲初始浓度条件下 GY2B菌的生长情况进行检测，结果如图 2所示.初始浓度为 100 mg ·L-1时， 24 h后菌密度不再出现明显的变化，进入稳定期； 而在初始浓度为 300 mg ·L-1时，菌密度在 36 h达到了最大， 48 h后急剧减少，到 72 h时已经下降了约 2个数量级.通常，当细菌不再具有在细菌培养基上长出明显菌落的能力时，即认为细菌细胞已经死亡[28].因此，初始浓度为 300 mg ·L-1时， 72 h后细菌开始大量死亡.
2.3 不同底物对 GY2B膜通透性(membrane permeability)的影响细胞膜的半透性使其在阻止细胞内物质释放到胞外的同时，也阻碍了营养物质的进入，这也导致了生物催化、 发酵及生物修复等生物过程的效率的降低,因此，在不同的营养条件下，细菌的细胞膜通透性的变化将会导致不同营养条件下细菌生长情况的不同[29].
本实验检测了营养肉汤(NB)、 100 mg ·L-1菲和无机盐培养基(MSM，不含碳源)这3种底物条件下 GY2B菌的膜通透性变化.如图 4所示，当底物为无机盐培养基时，其细胞膜通透性除了在最初有一定下降，并未发生较大的变化； 而营养肉汤为底物的条件下，其膜受损细胞(PI染色细胞数)所占比例较 MSM培养条件及菲培养条件均要高.
 | 图 4 不同底物培养条件下 GY2B 膜通透性变化 Fig. 4 Changes of GY2B membrane permeability cultivated at different substrates |
结合菌株生长曲线(图 5)分析,营养肉汤培养条件下 36 h时 GY2B已进入稳定期，至 48 h后已出现死亡现象.采用流式细胞仪分析相对应时期的死亡、 受损及完整细胞时发现，对数期时，受损细胞的比例即达到 98.15%，到稳定期时，受损细胞所占的比例更增至 98.68%，衰亡期则出现大量的死亡细胞(图 6)，这表明随着培养过程的进行， GY2B细胞的通透性发生明显改变.进一步采用傅里叶红外光谱对不同时期的细菌细胞表面物质进行检测(图 7)发现，稳定期及衰亡期时可检测到代表核酸分子存在的光谱(1 715~1 680 cm-1),而代表细胞膜结构的多糖、 脂多糖光谱信号 (1 200~900 cm-1)[30]一直存在.而根据文献报道， Pseudomonas putida在邻二甲苯的培养条件下，表面的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)及蛋白结构发生改变，导致表面的疏水性及渗透性发生变化[31].傅里叶红外光谱检测的结果进一步证明，培养过程中 GY2B细胞的膜结构依然存在，然而由于细胞膜通透性的改变使得完整性受到破坏，使得核酸分子泄漏，因此在细菌细胞表面可检测到代表核酸分子的官能团.
 | 图 5 营养肉汤培养条件下 GY2B生长曲线的变化 Fig. 5 Growth curves of strain GY2B cultivated at the condition of nutrient broth |
 | 图 6 营养肉汤培养条件下不同时期的死亡、 受损及完整细胞比例 Fig. 6 Proportion of death, damage and intact cell during different growth periods of GY2B cultivated under nutrient broth condition |
 | (a)对数期； (b)稳定期； (c)衰亡期 图 7 营养肉汤条件下不同时期的傅里叶红外光谱检测 Fig. 7 Results of Fourier transform infrared (FT-IR) absorbance spectroscopy detection of different growth periods of GY2B cultivated under nutrient broth condition |
图 8为不同浓度污染物对菌体膜通透性的影响，当菲的浓度为1.2 mg ·L-1及100 mg ·L-1时，随着时间的变化，GY2B菌的受损细胞所占比例在最初时有一定的下降，但最终其比例均会大于完整细胞，其中染色细胞/未染色细胞的比值分别为1.11和1.95.而300 mg ·L-1时，在8 h染色细胞/未染色细胞的比值升高后又再一次降低，并最终两者间的比值达到12.44. 对比生长曲线(图 3)，发现菲初始浓度为300 mg ·L-1时，36 h后菌密度大幅度下降，而菲初始浓度为1.2 mg ·L-1和100 mg ·L-1的条件下，其分别在8 h及24 h后进入稳定期.但图 8的结果显示，随着微生物的生长过程的进行，PI染色的GY2B菌细胞所占的比例在不断增加.则可推测：随着降解过程的进行，污染物菲对GY2B细菌细胞的表面结构产生了影响，尤其是对细胞膜结构产生了破坏作用，导致膜通透性的增大，从而使得受损细胞所占的比例增大.
 | 图 3 不同菲初始浓度条件下 GY2B的生长曲线 Fig. 3 Growth curves of strain GY2B at different initial phenanthrene concentrations |
 | 图 8 不同浓度菲对 GY2B菌膜通透性的影响 Fig. 8 Effects of different phenanthrene concentrations on membrane permeability of GY2B |
通过对100 mg ·L-1、 300 mg ·L-1菲初始浓度条件下的GY2B细菌细胞的红外检测(图 9和图 10)，发现随着降解的进行，100 mg ·L-1浓度条件下与营养肉汤培养条件下相似.此外，通过对不同时期的死亡、 受损及完整细胞比例检测发现，随着降解的进行，膜受损细胞比例不断增大，在24 h即有90.62%的受损细胞，这进一步说明主要为膜通透性的增大，促使菲进入细菌细胞内而被降解.
 | (a)对数期； (b)稳定期； (c)衰亡期 图 9 100 mg ·L-1菲初始浓度条件下不同时期的 傅里叶红外光谱检测 Fig. 9 Results of Fourier transform infrared (FT-IR) absorbance spectroscopy detection of different growth periods of GY2B cultivated under 100 mg ·L-1 phenanthrene |
 | (a)对数期； (b)稳定期； (c)衰亡期 图 10 300 mg ·L-1菲初始浓度条件下不同 时期的傅里叶红外光谱检测 Fig. 10 Results of Fourier transform infrared (FT-IR) absorbance spectroscopy detection of different growth periods of GY2B cultivated under 300 mg ·L-1 phenanthrene |
在300 mg ·L-1浓度条件下， 48 h时即出现了大量的死亡细胞(图 11)，其比例约为54.96%，这使得大量的GY2B细胞染上PI染料.此外，红外光谱的检测显示，随着降解过程的进行，代表肽聚糖、 脂多糖及磷酸分子结构的光谱区域(1 200~900 cm-1)[30]的峰型发生变化，而在此浓度条件下并未检测到代表DNA/RNA、 脂肪酸及Amide Ⅱ 的峰型，由此推断高浓度条件下，细胞膜结构的磷酸分子骨架、 脂肪酸及蛋白等发生改变，细胞膜的结构受到破坏，出现细胞溶解现象[8]，陈烁娜等[32]在研究苯并[a]芘-铜对嗜麦芽窄食单胞菌细胞表面特性变化时也发现高浓度BaP单独存在时，使细胞表面形成孔洞导致细胞膜通透性瞬间增大.而此时的检测结果也进一步验证高浓度的菲会使细胞表面形成孔洞导致细胞膜透性瞬间增大这一推论.
 | 图 11 100 mg ·L-1和300 mg ·L-1菲初始浓度条件不同时期的死亡、 受损及完整细胞比例Fig. 11 Proportion of death, damage and intact cell during different growth periods of GY2B cultivated under 100 mg ·L-1 and 300 mg ·L-1 phenanthrene |
降解过程中，污染物与细菌细胞的相互作用会改变细菌细胞表面的电荷， Zeta电荷越低越不利于黏附，通过测定细菌的 Zeta电位值可判断细菌表面所带电荷量的变化，了解污染物与细菌之间的相互作用，进一步了解菲对 GY2B的表面结构的影响.
图 12是不同浓度菲条件下菌体表面 Zeta电位随时间的变化情况，在菲初始浓度为 1.2 mg ·L-1的条件下，随着降解的进行， GY2B的 Zeta电位先有一定的增高，并在 12 h时达到最大值，此时 疏水性有机物菲与GY2B细胞表面最大程度黏附，48 h后其表面所带负电荷减少， Zeta电位值为-5 mV.其原因可能是：菲的毒性作用使得革兰氏阴性菌细胞膜结构被破坏，大量水分子及亲水性物质更易进入细胞内，使细菌细胞的体积和质量都增大，导致细胞电泳速度减小，从而出现了 Zeta电位增大的现象[34].根据膜通透性实验也发现 48 h时膜结构受损细胞(PI染色细胞)的比例明显上升， 进一步说明在降解过程中污染物处对细胞膜结构产生影响.
 | 图 12 不同浓度菲条件下菌体表面 Zeta电位随时间的变化 Fig. 12 Changes of cell-surface Zeta potential at different concentrations of phenanthrene |
此外，从图 12中还可以发现，初始浓度为 100 mg ·L-1和 300 mg ·L-1培养条件，其 Zeta电位分别在 24 h和 36 h开始增大，并最终有趋于稳定的趋势.实验中 Zeta电位的降低，可能是由于菲不断地累积于脂质双层导致GY2B菌细胞膜肿胀[33]，使100 mg ·L-1菲初始浓度条件下表面电势由-9.345 mV降低到-16.8 mV，300 mg ·L-1条件下表面电势由-5.73 mV降低到-20.3 mV，并且初始菲浓度越大，其表面电势减少的数值越大.Sikkemat等[34]在环烃类有机物对大肠杆菌(Escherichia coli)膜结构作用的研究中就曾发现，亲脂性有机物会累积于脂质双层导致细胞膜肿胀，这使得pH及表面电势降低，其中表面电势由-54 mV降低到-60 mV，使质子渗透率增大.
(1)在GY2B降解污染物菲的过程中，随着降解过程的进行， PI染色的细菌细胞增多，表明细胞膜通透性不断增大，膜结构受到一定的破坏.
(2) 不同底物会对GY2B菌的细胞膜的通透性产生影响.其中细菌细胞膜通透性在营养肉汤培养条件下较 MSM及 100 mg ·L-1菲为碳源条件下要大.
(3)不同菲浓度条件下GY2B菌的细胞膜变化结果表明：随着降解的进行，GY2B细胞的膜通透性均有所增加，利用傅里叶红外光谱及Zeta电位的检测也说明了细菌细胞表面渗透性发生了变化.在一定程度上，这有利于GY2B菌对菲的降解.但随着污染物浓度的升高，菲对降解菌的膜通透性的作用越大，且高浓度菲会使GY2B细胞膜瞬间产生孔结构，膜完整性受到严重破坏，造成GY2B细菌细胞大量溶解及死亡.
| [1] | Cerniglia C E. Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbon: a review[J]. Biodegradation, 1992, (8): 351-368. |
| [2] | Nam J J, Song B H, Eom K C, et al. Distribution of polycyclic aromatic hydrocarbons in agricultural soils in South Korea[J]. Chemosphere, 2003, 50 (10): 1281-1289. |
| [3] | Halsall C J, Barrie L A, Fellin P, et al. Spatial and temporal variation of polycyclic aromatic hydrocarbons in the arctic atmosphere[J]. Environmental Science and Technology, 1997, 31 (12): 3593-3599. |
| [4] | Timmis K N, Steffan R J, Unterman R. Designing microorganisms for the treatment of toxic wastes[J]. Annual Review of Microbiology, 1994, 48 (1): 525-557. |
| [5] | Czechowska K, Van der Meer J R. A flow cytometry based oligotrophic pollutant exposure test to detect bacterial growth inhibition and cell injury[J]. Environmental Science and Technology, 2011, 45 (13): 5820-5827. |
| [6] | 刘晔, 牟伯中, 刘洪来. 烃的微生物摄取机制研究进展[J]. 微生物学通报, 2005, 32 (2): 109-113. |
| [7] | Saxon E, Carolyn R B. Cell surface engineering by a modified staudinger reaction[J]. Science, 2000, 287 (5460): 2007-2010. |
| [8] | Ramos J L, Gallegos M T, Marqués S, et al. Responses of Gram-negative bacteria to certain environmental stressors[J]. Current Opinion in Microbiology, 2001, 4 (2): 166-171. |
| [9] | Baumgarten T, Vazquez J, Bastisch C, et al. Alkanols and chlorophenols cause different physiological adaptive responses on the level of cell surface properties and membrane vesicle formation in Pseudomonas putida DOT-T1E[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012, 93 (2): 837-845. |
| [10] | Wick L Y, De Munia A, Springale D, et al. Responses of Mycobacterium sp. LB501T to the low bioavailability of solid anthracene[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2002, 58 (3): 378-385. |
| [11] | Kato M, Hayashi R, Tsuda T, et al. High pressure-induced changes of biological membrane[J]. European Journal of Biochemistry, 2002, 269 (1): 110-118. |
| [12] | 姚春艳, 刘美凤, 付瑞东, 等. 加压CO2对大肠杆菌细胞膜的损伤作用[J]. 微生物学通报, 2013, 40 (2): 256-265. |
| [13] | Schmid I, Uittenbogaart C H, Giorgi J V. Sensitive method for measuring apoptosis and cell surface phenotype in human thymocytes by flow cytometry[J]. Cytometry, 1994, 15 (1): 12-20. |
| [14] | Alcon A, Santos V E, Casas J A, et al. Use of flow cytometry for growth structured kinetic model development: application to Candida bombicola growth[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2004, 34 (5): 399-406. |
| [15] | Gray D R, Yue S, Chueng C Y, et al. Bacterial vitality detected by a novel fluorogenic redox dye using flow cytometry[EB/OL]. https://zh.invitrogen.com/etc/medialib/en/filelibrary/cell_tissue_analysis/pdfs.Par.62303.File.tmp/RedoxSensor%20Green%20poster.pdf.html, 2005-6-9. |
| [16] | Baatout S, Leys N, Hendrickx L, et al. Physiological changes induced in bacteria following pH stress as a model for space research[J]. Acta Astronautica, 2007, 60 (4-7): 451-459. |
| [17] | Vives-Rego J, Lebaron P, Nebe-Von C G. Current and future applications of flow cytometry in aquatic microbiology[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2000, 24 (4): 429-448. |
| [18] | Verthé K, Verstraete W. Use of flow cytometry for analysis of phage-mediated killing of Enterobacter aerogenes[J]. Research in Microbiology, 2006, 157 (7): 613-618. |
| [19] | Tao X Q, Lu G N, Dang Z, et al. Isolation of phenanthrene-degrading bacteria and characterization of phenanthrene metabolites[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2007, 23 (5): 647-654. |
| [20] | Tao X Q, Lu G N, Dang Z, et al. A phenanthrene-degrading strain Sphingomonas sp. GY2B isolated from contaminated soils[J]. Process Biochemistry, 2007, 42 (3): 401-408. |
| [21] | Muller S, Nebe-Von-Caron G. Functional single-cell analyses: flow cytometry and cell sorting of microbial populations and communities[J]. FEMS Microbiology Reviews, 2010, 34 (4): 554-587. |
| [22] | Soejima T, Iida K, Takashi S, et al. Discrimination of live, anti-tuberculosis agent-injured, and dead Mycobacterium tuberculosis using flow cytometry[J]. Federation of European Microbiological Societies, 2009, 294 (1): 74-81. |
| [23] | Al-Qadiri H M, Lin M, Al-Holy M A, et al. Detection of sublethal thermal injury in Salmonella enterica serotype typhimurium and Listeria monocytogenes using fourier transform infrared(FT-IR) spectroscopy(4000 to 600 cm-1)[J]. Journal of Food Science, 2008, 73 (2): 54-61. |
| [24] | Abbasnezhad H, Gray M R, Foght J M. Two different mechanisms for adhesion of Gram-negative bacterium, Pseudamonas fluorescens LP6a, to an oil water interface[J]. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2008, 62 (1): 36-41. |
| [25] | Berney M, Hammes F, Bosshard F, et al. Assessment and interpretation of bacterial viability by using the LIVE/DEAD BacLight Kit in combination with flow cytometry[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2007, 73 (10): 3283-3290. |
| [26] | Shi L, Günther S, Hübschmann T, et al. Limits of propidium iodide as a cell viability indicator for environmental bacteria[J]. Cytometry Part A, 2007, 71A (8): 592-598. |
| [27] | Nocker A, Richter-Heitmann T, Montijn R, et al. Discrimination between live and dead cells in bacterial communities from environmental water samples analyzed by 454 pyrosequencing [J]. International Microbiology, 2010, 13 : 59-65. |
| [28] | Hewitt C J, Nebe-Von-Caron G. The application of multi-Parameter flow cytometry to monitor individual microbial cell physiological state[J]. Advanced Biochemical Engineering Biotechnology, 2004, 89 : 197-223. |
| [29] | Kell D B, Ryder H M, Kaprelyants A S, et al. Quantifying heterogeneity: flow cytometry of bacterial cultures[J]. Antonie van Leeuwenhoek, 1991, 60 (3-4): 145-158. |
| [30] | Lin M S, Al-Holy M, Al-Qadiri H, et al. Discrimination of intact and injured Listeria monocytogenes by fourier transform infrared spectroscopy and principal component analysis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2004, 52 (19): 5769-5772. |
| [31] | Pinkart H C, Wolfram J W, Rogers R, et al. Cell envelope changes in solvent-tolerant and solvent-sensitive Pseudomonas putida strains following exposure to o-xylene[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62 (3): 1129-1132. |
| [32] | 陈烁娜, 尹华, 叶锦韶, 等. 嗜麦芽窄食单胞菌处理苯并[a]芘-铜复合污染过程中细胞表面特性的变化[J]. 化工学报, 2012, 63 (5): 1592-1597. |
| [33] | LaPolla R J, Haron J A, Kelly C G, et al. Sequence and structural analysis of surface protein antigenⅠ∕Ⅱ(SpaA) of Streptococcus sobrinus[J]. Infection and Immunity, 1991, 59 (8): 2677-2685. |
| [34] | Sikkemat J, De Bont J A M, Poolman B, et al. Interactions of cyclic hydrocarbons with biological membrane[J]. Journal of Biological Chemistry, 1994, 269 (11): 8022-8028. |