本实验培养基为IOP无机盐培养基，通过在无机盐溶液中加入IOP和外加碳源(淀粉、 葡萄糖、 麦芽糖或甘油)，投加浓度分别为30 mg ·L^-1和1 g ·L^-1. 空白样(即对照组的培养基)仅由无机盐培养基和IOP组成，无任何外加碳源. 无机盐溶液的组成如下(g ·L^-1)：K₂HPO₄ 4.35，KH₂PO₄ 1.7，NH₄Cl 2.1，CaCl₂ ·2H₂ O 0.03，FeSO₄ ·7H₂ O 0.01，MgSO₄ 0.2，MnSO₄ 0.05，pH为6.8~7.2，培养基使用前先在121℃下高温灭菌20 min. IOP注射液[37 g(I) ·(100 mL)^-1]购自德国拜耳公司，乙腈(HPLC级)购自美国Honeywell Burdick&Jackson 公司，碘硝基四唑紫(INT，98.0%)购自日本TCI公司，其它化学药剂均购自国药集团.

IOP储备液的配制方法如下：使用无菌注射器从IOP注射液小瓶中抽取0.2 mL，使用蒸馏水稀释并定容至50 mL，即得浓度为3 g ·L^-1的IOP储备液，在4℃条件下保存备用.

Tris-HCl溶液(pH 7.1)配制方法如下：将50 mL 0.1 mol ·L^-1三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与45.7 mL 0.1 mol ·L^-1 盐酸混匀后，加水稀释至100 mL.

高效液相色谱仪(Agilent 1100，安捷伦科技(中国)有限公司)、 高速冷冻离心机(Thermo，赛默飞世尔科技(中国)有限公司)、 恒温水浴锅(DK-S22，上海精宏实验设备有限公司)、 紫外-可见分光光度计(TU-1810，北京普析通用仪器公司)、 超声波细胞破碎机(JY 96-Ⅱ，浙江新芝公司)，恒温摇床(DKY-Ⅱ，上海杜科自动化有限公司).

本实验室在前期研究中从城市污水处理系统活性污泥中筛选分离出1株能够高效降解IOP的菌株，经鉴定属恶臭假单胞菌(Pseudomonas sp.)，命名为I-24，菌株具体筛选方法及其生理生化特性见文献[16].

将待测菌液以4℃、 8000 r ·min^-1的条件离心15 min后，将上清液通过0.45 μm滤膜过滤，然后采用高效液相色谱进行定量检测分析，检测器为二极管阵列检测器，流动相为乙腈/水=9/91(体积比)，色谱分离柱为Eclipse XDB C18(150 mm×4.6 mm×5 μm)，色谱条件如下：流速0.4 mL ·min^-1，柱温25℃，检测波长242 nm，进样量20 μL，每个样品测定3次，取平均值.

向培养基中投加体积分数为10%的菌液，在30℃和180 r ·min^-1的条件进行培养，每日测定发酵液的 D600 值，为期7 d，从而可得菌株I-24的生长曲线.

取0.5 mL菌液与1 mL 浓度为2%的INT进行混合，避光培养20 min后加入0.1 mL浓度为37%的甲醛终止反应，混匀后，在10000 r ·min^-1转速下离心5 min，倒去上清液，加入4 mL浓度为96%的甲醇进行充分溶解沉淀，再在10000 r ·min^-1转速下离心5 min，取上清液进行 D495 测定. ETSA活性计算方法如下：ETSA=D₄₉₅V/kmt，式中，ETSA单位为μg ·(g ·h)^-1，V为萃取剂体积(mL)，k为标准曲线斜率，m为菌体干重(g)，t为培养时间(h).

基于上清液与菌体分别破碎所得的胞外酶与胞内酶酶活力进行测定，得出胞外酶对IOP无降解去除效果，因此随后的实验均采用胞内酶进行酶活力测定. 测定方法如下：取40 mL菌液， 在8000 r ·min^-1转速下离心30 min，倒去上清液，加入4 mL pH=7.1的Tris-HCl缓冲液清洗菌体，再以8000 r ·min^-1离心30 min，倒去上清液，重复清洗一次，加入20~30 mL Tris-HCl缓冲液进行混匀沉淀，然后放入超声波细胞破碎机中冰浴破碎30 min，破碎条件如下：功率300 W，工作时间2 s，休息时间1 s，破碎完成后即得粗酶液，标记为IOP降解酶； 取1 mL粗酶液稀释约含100 mg ·L^-1蛋白质的溶液，加入3 mL pH=7.1的Tris-HCl缓冲液、 1 mL浓度为15 mg ·L^-1的IOP溶液，然后将其置于30℃恒温水浴锅中培养2 h，空白组置于80℃水浴中灭活10 min，然后在12000 r ·min^-1转速下离心20 min，取上清液在242 nm处测定吸光度，以空白组与样品组的吸光度之差与IOP标准曲线比对计算酶活力，IOP降解酶的活力单位(U)定义为单位时间(min)降解1 μmol IOP所需的酶量. 测定时每次3组平行样，取平均值.

不同外加碳源下，降解菌I-24对IOP共代谢降解效果如图 2所示. IOP的稳定结构使其难以为微生物直接利用，在无任何外加碳源的情况下，空白样培养基中的IOP浓度基本无任何变化，通过5日培养后，空白样中IOP的去除率仅为1.34%，相比存在外加碳源条件下，降解菌I-24在单IOP基质条件下对其基本无去除效果.

图 2

Fig. 2

图 2 外加碳源对IOP降解过程的影响 Fig. 2 Effects of additional carbon sources on IOP degradation

在共代谢条件下，淀粉作为外加碳源时对IOP的降解去除具有显著的促进作用，其5日降解去除率可达92.7%. 与此同时，投加葡萄糖、 麦芽糖或甘油的培养基中，经检测分析可知，IOP的降解去除率分别为62.2%，54.5%和44.0%，虽然不同外加碳源对IOP的降解去除促进效果不尽相同，但相比无外加碳源时均有明显提高. 与此同时，通过对IOP质量浓度(ρ/mg ·L^-1)和降解时间(t/d)进行拟合分析(表 1)可知，降解菌I-24对IOP的降解符合一级反应动力学特征，拟合的动力学方程能较好地描述降解菌对IOP降解反应的变化趋势.

表 1(Table 1)

表 1 不同外加碳源下IOP降解动力学参数 Table 1 Kinetic parameters of IOP degradation with different additional carbon sources 外加碳源 动力学方程 R2 淀粉 ln ρ=-0.57 t+3.88 0.946 麦芽糖 ln ρ=-0.16 t+3.50 0.964 葡萄糖 ln ρ=-0.20 t+3.55 0.975 甘油 ln ρ=-0.11 t+3.46 0.936

表 1 不同外加碳源下IOP降解动力学参数 Table 1 Kinetic parameters of IOP degradation with different additional carbon sources

有研究报道采用淀粉和葡萄糖作为外加碳源共代谢难生物降解有机物^{[17, 18]}，虽然葡萄糖在特定条件下对共代谢过程存在抑制作用^[19]，但绝大多数情况下，葡萄糖在共代谢过程中对目标污染物的促进作用比淀粉更为显著，分析原因可能是淀粉的多糖分子结构相比葡萄糖的单糖和麦芽糖的双糖分子结构更为复杂，不利于降解微生物迅速代谢吸收. 尽管如此，本研究结果表明，相比葡萄糖，淀粉对I-24共代谢降解IOP的促进作用更为显著，其原因可能是降解菌I-24对淀粉的存在更为敏感，能够有效地促进降解菌I-24中降解IOP的活性基团发挥作用，从而达到高效降解IOP的目的.

图 3为降解菌I-24在IOP共代谢过程中的生长变化曲线，分析可知，以葡萄糖作为外加碳源时，降解菌I-24生长情况最佳，其D600在培养第1 d即达到0.740，而以麦芽糖和淀粉作为外加碳源时，降解菌I-24的生长速率虽不及以葡萄糖作为外加碳源时的生长速率，但也同样在第1 d后即进入稳定生长期. 相比之下，以甘油作为外加碳源时，降解菌I-24的生长速率较为缓慢，其D600在第2 d时为0.583，可能是因为甘油的分子结构相对复杂，降解菌I-24对其代谢较慢，对其生长产生一定的抑制作用. 尽管如此，根据2.1节的分析结论，降解菌的生长情况与IOP降解去除率并无直接联系，Nie等^[20]也报道过类似的现象.

图 3

Fig. 3

图 3 共代谢过程中I-24的生长曲线 Fig. 3 Growth curve of strain I-24 during co-metabolism process

与此同时，在以IOP为唯一碳源的空白样中，降解菌I-24的生长基本处于稳定不增殖的状态，以D600作为判别标准已无法指示出降解菌的生长周期. 由于IOP的苯环结构使得降解菌I-24对其难以有效地代谢，因此只能通过内源代谢以保持其活性，结合前述所得结论，表明降解菌I-24只有在获得充足能量，保持其正常生长的条件下，才能对IOP进行有效降解. 但是，一旦共代谢基质易于被代谢吸收，也会导致IOP与共代谢基质之间形成竞争作用，因此降解菌I-24利用共代谢基质进行生长繁殖受到抑制，从而降低IOP的降解去除率.

ETSA是指微生物呼吸链上电子的传递速率，通过测定好氧条件下微生物的呼吸活性可以间接表示活性微生物量及其对有机物的代谢能力^{[21, 22]}. 若微生物细胞内发生氧化还原反应时，INT因接受氢原子而被还原，并发生颜色变化，通过还原后溶液的颜色变化可考察酶对底物(INT)的反应活性^[23]，从而判断还原型辅酶经过电子传递再氧化的效率^[24]. 图 4为不同外加碳源条件下降解菌I-24共代谢IOP过程中ETSA变化情况，分析可知，随着时间的延长，各系统中微生物的活性均呈现下降趋势，并在第4 d左右达到稳定，与D600的变化趋势类似，空白样中ETSA值始终处于较低水平. 由于ETSA主要由基质代谢活性与内源呼吸代谢活性两部分组成^[25]，外加碳源作为电子供体能加速基质ETSA的释放，因此当不存在有效的碳源提供电子供体时，降解菌I-24的内源呼吸代谢活性远低于其它外加碳源培养基中的活性，仅为2.5 μg ·(g ·h)^-1左右. 相比之下，麦芽糖所释放的代谢活性最强，培养第1 d为32.12 μg ·(g ·h)^-1，约为淀粉所释放的两倍[17.28 μg ·(g ·h)^-1]. 由于降解微生物对小分子类电子供体的利用率较高，可释放出较多的基质代谢脱氢酶^[10]，麦芽糖是一种双糖，结构简单，且易被分解成单糖，从而促进基质ETSA的释放，而淀粉的多糖结构水解步骤较多，但到反应后期，大量的淀粉水解产物逐渐减缓了ETSA的下降速率.

图 4

Fig. 4

图 4 共代谢过程中外加碳源对I-24 ETSA的影响 Fig. 4 Effects of additional carbon sources on ETSA of I-24 during co-metabolism process

尽管如此，由上述分析可知，淀粉的存在对降解菌I-24的共代谢过程具有更为显著的促进作用，说明ETSA只能作为降解菌I-24反应活性的一个表征数值，而无法将其与IOP的共代谢过程建立直接的相关关系，或者说，降解菌I-24共代谢对IOP的共代谢过程只与其内部关键酶有关.

图 5为降解菌I-24共代谢过程中IOP降解酶活力的变化情况. 由于测定时，粗酶液的蛋白质浓度均被稀释至大约为100 mg ·L^-1，因此酶比活力与酶活力的变化趋势是一致的，本节内容选择酶活力作为比较数据. 由图 5分析可知，当外加碳源为淀粉时，降解菌酶活力在第3 d可达0.182 mU，而在其它条件情况下，降解菌酶活力分别为：麦芽糖0.119 mU、 空白样0.074 mU、 葡萄糖0.053 mU和甘油0.046 mU. 空白样中降解菌I-24虽然生长情况一般，ETSA活性较低，对IOP的降解去除效果较差，但其酶活力却高于葡萄糖和甘油培养基，分析可知，内源代谢虽然抑制降解菌I-24对IOP的降解作用，但仍可诱导降解关键酶的产生，只是其活性受到抑制. 通过超声破碎将粗酶液提取后，关键酶在适宜的条件下仍可恢复其活性.

图 5

Fig. 5

图 5 共代谢过程中IOP降解酶活力 Fig. 5 IOP-degrading enzymatic activity during co-metabolism process

在第3 d后，各个培养基中降解菌I-24的酶活力呈逐渐下降趋势，分析原因可能是IOP降解过程中所产生的代谢产物发生累积，从而对关键酶产生一定的毒性抑制作用，同时关键酶自身的老化也会影响其活性，即使相关的蛋白酶能够修复关键酶，减弱代谢产物的毒性，但也只能减缓酶活力的下降速率.

有研究报道，外加碳源浓度的不同会对共代谢结果产生影响^[26]，同样也会影响关键酶活力. 本研究3组无机盐培养基中分别加入浓度为0.5、 1、 1.5和2 g ·L^-1的淀粉和30 mg ·L^-1的IOP，在培养2 d后对酶活力进行测定，结果如图 6所示，分析可知，当淀粉投加浓度为1 g ·L^-1时，降解菌I-24的酶活力最高，达0.114 mU. 淀粉的投加可以促进IOP的共代谢降解，但当淀粉浓度偏低时，无法满足微生物生长繁殖的需要，从而影响对关键酶的诱导，而当淀粉浓度过高时，降解菌I-24会大量代谢淀粉，影响降解IOP基因的有效表达，与IOP产生竞争性抑制^[27].

(1)考察了淀粉、 麦芽糖、 葡萄糖和甘油对降解菌Pseudomonas sp. I-24共代谢IOP的影响，结果表明以淀粉作为外加碳源时，降解菌I-24对IOP的降解效果最好，可达92.7%，之后依次为葡萄糖、 麦芽糖和甘油，空白样中IOP难以生物降解. 此外，降解菌I-24对IOP的降解过程符合一级反应动力学.

(2)外加碳源对降解菌I-24的生长具有明显的促进作用，并且降解菌I-24在含有葡萄糖的培养基中生长情况最佳.

(3)降解菌I-24在含有麦芽糖的培养基中电子呼吸系统活性最高，可达32.12 μg ·(g ·h)^-1，但通过ETSA与IOP降解过程进行对比分析可知，ETSA与共代谢过程无明显的直接关系.

(4)当以淀粉作为外加碳源时，IOP降解酶活力在第3 d可达0.182 mU，且淀粉的最佳投加量为1 g ·L^-1，同时空白样中降解菌I-24同样具有酶活力，表明关键酶的诱导即使在低基质条件下也可进行，过高或过低的外加碳源浓度均会抑制关键酶的诱导与表达.