污泥取自沈阳开发区某水厂运行稳定的生物除锰滤池的成熟锰砂池，驯化和试验培养基配方(PYCM)^[23]为：0.8 g蛋白胨，0.2 g酵母粉，0.2 g MnCl₂ ·4H₂ O，0.1 g K₂HPO₄，0.2 g MgSO₄ ·7H₂ O，0.2 g NaNO₃，0.1 g CaCl₂，0.1 g (NH₄)₂CO₃，1L超纯水，pH为6.8~7.2，121℃湿热灭菌20 min.为防止MnCl₂在高温灭菌时被氧化，待已灭菌的无锰培养基冷却至室温后，再将 MnCl₂通过0.22 μm微孔膜过滤加入.含铁的PYCM培养基在上述培养基加入柠檬酸铁铵(1.0 g ·L^-1).将采集的污泥按20%(体积比)的量接种到高锰含铁培养基中，于30℃，150 r ·min^-1富集培养，每5 d换一次营养液，经稀释涂布、 平板划线获得纯锰氧化细菌.

收集处于对数生长期菌体，采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒V2.2(上海申能博彩生物科技有限公司)对细菌总DNA进行提取和纯化.以纯化后的总DNA为模板，选用细菌通用引物27F/20：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′和1492/20； 5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR扩增^[24]. PCR反应体系(50 μL)：5 μL 10×PCR Buffer(Mg²⁺15 mmol ·L^-1)、 4 μL dNTP Mixture(2.5 mmol ·L^-1)、 1 μL 引物1 BSF27/20(20 μmol ·L^-1)、 1 μL 引物2 BSR1492/20(20 μmol ·L^-1)、 0.25 μL Taq DNA聚合酶、 1 μL DNA模板，37.5 μL dd H₂ O.扩增条件：94℃预变性5 min，30个循环(94℃变性60 s，53℃退火60 s，72℃延伸120 s)，最终72℃延伸5 min，4℃保温10 min.PCR产物测序工作由上海华大生物技术有限公司完成.将测序结果与 GenBank数据库中的基因序列进行比对后，用Clustelx(1.81)对选取的长度1 400 bp左右的序列进行同源性分析，再用MEGA5软件采用邻位连接法建立系统发育树，进行系统学分析，确定菌株种属情况及其在遗传学上的地位.

在进行16S rDNA分析的同时，运用Biolog技术对微生物属名进行验证，提高菌株鉴定的可靠性.将待测菌株活化后接入新鲜的BUG+B培养基，30℃培养过夜.用无菌棉签挑取已培养好的菌落接种到浊度管(选用IF-A接种液)中，调整浊度后再用排枪接种到Biolog碳源板(选用GN-Ⅲ)，于30℃恒温培养.分别在培养4~6 h、 16~24 h后用Biolog鉴定仪读取相应的数据，得到菌株鉴定结果.BUG+B培养基配置如下：250 mL锥形瓶中加入95 mL超纯水，5.7 g BUG琼脂培养基，煮沸溶解后(冷却后pH一般为7.3±0.1)，121℃灭菌15 min，冷却至45~50℃后，加5 mL新鲜的脱纤羊血.

生理生化实验参照文献[25].

将菌悬液(D600=0.1)按1%量(体积比)接种于有锰(1.0 mmol ·L^-1)的PYCM培养基中，于30℃、 150 r ·min^-1、 pH为6.8~7.2条件下培养，相隔一定时间取样用分光光度计测D600，绘制生长曲线.同时测定培养液中pH变化并用LBB指示剂法测定生物氧化锰的生成量^[23].

锰耐受性实验培养基Mn²⁺初始浓度分别为：0、 5.0、 10.0、 20.0、 30.0、 40.0、 50.0、 60.0、 70.0 mmol ·L^-1，在上述同样条件培养，于60 h和5 d取样，分别测D600、 生物氧化锰生成量和锰离子剩余量.

考察有锰(1.0 mmol ·L^-1)的PYCM培养基中各形态锰在不同阶段的含量变化，实验中不同形态锰的测定方法：①取5 mL菌悬液，于12 000 r ·min^-1、 4℃条件下离心10 min，上清液用0.22 μm滤膜过滤后原子吸收法测锰，为培养基中剩余的Mn(Ⅱ)浓度； ②离心后的菌体用等体积的50 mmol ·L^-1CuSO₄溶液复溶，振荡反应过夜，待吸附的Mn²⁺彻底被Cu²⁺置换出后，于12 000 r ·min^-1、 4℃条件下离心10 min，上清液用0.22 μm滤膜过滤后原子吸收法测锰，为被吸附的Mn(Ⅱ)浓度； ③再将离心后沉淀用等体积的20 mmol ·L^-1盐酸羟胺处理10 h以上，将高价态的锰氧化物还原成Mn²⁺，于12 000 r ·min^-1、 4℃条件下离心10 min，上清液用0.22 μm滤膜过滤后原子吸收法测溶液中Mn²⁺，为被生物氧化成生物氧化锰的Mn(Ⅱ)浓度.

将菌悬液(D600=0.1)按1%量(体积比)接种于PYCM培养基中，转速为150 r ·min^-1.在考察最适温度实验中，培养基pH为7.0，Mn²⁺浓度为1.0 mmol ·L^-1，控制不同培养温度(10、 15、 20、 25、 30、 35、 40、 45℃)； 在探究最适pH实验中，温度为30℃， Mn²⁺浓度为1.0 mmol ·L^-1，控制不同pH值(4.0、 5.0、 6.0、 7.0、 8.0、 9.0、 10.0)； 在探究最适含铁量实验中，培养基pH为7.0，温度为30℃，Mn²⁺浓度为1.0 mmol ·L^-1，控制不同铁浓度(0、 0.25、 0.5、 0.75、 1.0、 1.25、 1.5、 2.0 g ·L^-1).以上实验中菌体培养60 h后取样测D600，培养5 d后取样经0.22 μm滤膜过滤后原子吸收法测锰离子浓度，计算锰氧化率，分析确定最适温度、 pH、 含铁量 (3次平行实验).

在生成的高价生物氧化锰中或其生成的过程中，氧化活性很高的Mn(Ⅲ)中间体可能存在并起到重要作用.Mn(Ⅲ)能与有机酸络合，这些络合物再从酶的活性部位扩散开来，成为一类重要的氧化剂.由于Mn(Ⅲ)能与焦磷酸钠形成稳定的络合物，且该络合物在480 nm处有最大吸收峰，本实验用10 mmol ·L^-1焦磷酸钠作为捕捉剂对氧化过程中可能存在的Mn(Ⅲ)进行捕捉^[26].将菌悬液按1%量(体积比)接种于含铁的高锰(10 mmol ·L^-1)PYCM培养基中，在pH为7.0、 温度为30℃和转速为150 r ·min^-1的条件下培养5 d后，加入焦磷酸钠(10 mmol ·L^-1)，反应4 h后经0.22 μm 滤膜过滤，用分光光度法于波长480 nm处检测Mn(Ⅲ)-焦磷酸钠络合物的情况.

将菌株接种于有锰(1.0 mmol ·L^-1)和无锰两种加铁PYCM培养基中，30℃、 150 r ·min^-1培养3 d，获得培养液.① 将培养液于4℃，4 000 r ·min^-1离心10 min，弃去沉淀物，获得上清液； ② 将培养液于4℃，2 500 r ·min^-1离心2 min，弃去沉淀物，上清液于4℃，4 000 r ·min^-1离心10 min，收集菌体沉淀.菌体用pH 7. 0的Tris-HCl 缓冲液洗涤2次，除去菌体表面粘附物，再用pH 7. 0的Tris-HCl 缓冲液制成菌悬液； ③取少量上述所得菌悬液，用超声波处理使细胞破裂，再6 000 r ·min^-1离心10 min，弃沉淀，获得细胞裂解液(注:有锰的菌体记为YJ，有锰上清液记为YS，有锰菌液记为YP，有锰裂解液YL，无锰菌体WJ，无锰上清液WS，无锰菌液WP，无锰裂解液WL，空白记为KB).将500 μL 200 mmol ·L^-1MnCl₂母液分别加入上述培养物中，于30℃、 150 r ·min^-1恒温摇床反应2 h，测定锰氧化率.

将含生物氧化锰的菌悬液2 500 r ·min^-1离心2 min，弃沉淀，上清液(含有吸附生物氧化锰的菌体)于12 000 r ·min^-1、 4℃离心10 min，沉淀于2.5%戊二醛溶液中4℃固定过夜，然后经预处理，采用Philip XL-30-ESEM(EDX)环境扫描电镜对细菌表面的生物氧化锰进行表征.

将含生物氧化锰的菌悬液12 000 r ·min^-1、 4℃离心10 min，收集含生物氧化锰沉淀，用无菌水洗涤3遍后低温(-50℃)冷冻干燥，粉末压片处理后，采用XPert Pro高分辨多晶X射线衍射仪(CuKα源、 λ=0.154 nm、 Ni滤波)对样品进行X射线衍射(XRD)测试.管电流为40 mA，管电压为40 kV，扫描速度为4° ·min^-1，2θ扫描范围10°~80°.

同时对上述冷冻干燥粉末进行X射线光电子能谱(XPS)分析.X射线光电子能谱仪条件为：双阳极Al/Mg靶X射线源及单色化Al靶X射线源，最大功率450 W，样品分析室最小压强小于3×10^-10 Torr.

从用锰定向驯化的活性污泥中，经初筛、 复筛、 分离纯化获得1株锰氧化菌株，命名为H1.通过透射电镜观察和革兰氏染色发现H1呈无牙胞短杆状，侧生鞭毛，是革兰氏阴性菌(见图 1).按照文献[27，28]对H1进行生理生化分析，结果如表1所示.PCR产物的16S rDNA基因序列长度与电泳检测结果吻合，16S rDNA序列在GenBank进行BLAST同源性对比发现，H1与多株Amimobacter sp. 有99%的同源性，结合生理生化特征，确定H1为氨基杆菌(Amimobacter sp.)，获得GenBank登录号为JX457318，中国典型培养物保藏中心(武汉)保藏号为M2012296.以16S rDNA序列为基础，应用Glustalxl.2.0进行同源性排列，再利用MEGA5软件构建的系统发育树如图 2. Biolog分析同16S rDNA的分析结果基本一致.查阅相关文献，国内外还未有Aminobacter sp. 菌株具有Mn²⁺氧化能力的相关研究报道.

图 1

Fig. 1

图 1 菌株 H1微观形态 Fig. 1 Microscopy images of strain H1

图 2

Fig. 2

图 2 菌株系统发育树图Fig. 2 Phylogenetic tree of strain H1

表 1(Table 1)

表 1 菌株生理生化结果1) Table 1 Physiological and biochemical responses of strain H1 试验项目 结果 革兰氏染色 - 淀粉水解试验 - 吲哚试验 - 甲基红试验 - V-P试验 - 氧化酶试验 + 明胶液化试验 - 过氧化氢酶试验 + 硫化氢试验 - 产氨试验 + 硝酸盐还原试验 + 1)“+”表示阳性，“-”表示阴性

表1 菌株生理生化结果1) Table 1 Physiological and biochemical responses of strain H1

由图 3可知，Aminobacter sp. H1生长的各阶段较明显，约48 h后进入稳定生长期，72~80 h开始呈现下降趋势，细菌繁殖速度变慢，死亡个体数增多，进入衰亡期.培养基中Mn(Ⅱ)在12 h内就有少量被氧化，但直到42 h生物氧化锰的生成量仍很少，约0.015 mg ·L^-1， 42 h后氧化速率显著提高， 80 h时基本稳定，生物氧化锰量超过0.16 mg ·L^-1.后续实验中也发现Mn(Ⅱ)一开始就大量减少，由此可推出菌H1通过吸附作用吸附Mn(Ⅱ)，待生长到一定阶段后再把其氧化.同时从图 3中也可看出在细菌生长过程中，菌液pH值不断发生变化，呈上升趋势，80 h内pH值从6.5上升到8.6，这可能是因为菌在生长过程中产生或分泌碱性物质，pH值升高能促进H1对锰的氧化，同时对菌的生长也会产生一定的影响.而空白实验中生物氧化锰量和pH都没有变化，说明锰氧化和pH升高是菌株H1作用的结果.

图 3

Fig. 3

图 3 H1生长曲线、 生物氧化锰生成、 菌液pH变化 Fig. 3 Growth curve of strain H1, production of biogenic Mn oxide and pH variation in PYMC medium

由图 4(a)可知，当培养基中Mn²⁺浓度为小于30 mmol ·L^-1时，菌株H1生长几乎不受影响且具有较高的锰氧化活性； 但当Mn²⁺浓度为40~50 mmol ·L^-1时，菌株H1生长和锰氧化活性均受到明显抑制； Mn²⁺浓度升至60~70 mmol ·L^-1时，菌株H1已不能生长且对Mn²⁺无氧化作用.Mn²⁺对菌株H1影响的最低抑制浓度为50 mmol ·L^-1，此高锰耐受性菌株在工程中具有潜在的应用价值.

另一方面，锰氧化菌在不同生长阶段的锰氧化能力有较大差异，各形态锰在不同阶段的量如图 4(b).从游离态锰变化曲线可看出H1能够快速而高效地去除锰，6 h时即有38%的锰被去除，到168 h时，培养基中95%的锰已被去除.另外，24 h内游离态锰量迅速减少，吸附态锰的量相应增加，而生物氧化锰量仍很少，可知道这一阶段主要是菌体对锰的吸附.24 h后生物氧化锰量开始增加，但吸附态锰仍然远远多于生物氧化锰，36 h时吸附渐渐达到饱和，这可能与菌生长达到稳定期，菌体总表面积有限有关.生物氧化锰的量则仍持续增加，到168 h时生物氧化锰量仅稍小于吸附态锰.说明锰的氧化滞后于锰的吸附，H1首先通过吸附大量去除培养基中的锰，然后再把吸附的锰氧化成生物氧化锰或作为自身生长所需要的营养元素.

图 4

Fig. 4

图 4 菌株H1的Mn(Ⅱ)耐性及其对锰的氧化去除Fig. 4 Mn(Ⅱ) tolerance, oxidation and removal curve of strain H1

图 5(a)可见，pH从4.0上升到10.0，菌的生物量和锰氧化率都是先增大再减小，在7.0时达到最大，锰氧化率为61.5%.由此可知，在pH为6.0~8.0的条件下，菌株H1能较好生长，且对Mn²⁺氧化率均在40%以上，最高达到62%.这可能由于H1对锰的氧化是酶促反应，过酸或过碱会使H1所分泌的起氧化作用的酶分子结构或表面基团发生变化，导致酶活性降低或酶与底物的结合受阻.同时培养基的pH也会引起细胞膜电位的变化，影响菌株对营养物质的摄取及代谢过程中酶的活性.

图 5

Fig. 5

图 5 pH值、 温度、 Fe初始质量浓度对锰氧化率的影响 Fig. 5 Effects of initial pH, temperature and Fe concentration on Mn oxidation

由图 5(b)可知，温度为35℃时，菌的生长和Mn²⁺氧化效果最佳，氧化率为62.3%，菌的生物量也最大； 温度低于35℃时，菌株的生长量和对Mn²⁺氧化率都随培养温度降低而减少； 当温度超过35℃时，菌株的生长和对Mn²⁺氧化率都受到明显抑制.温度的影响主要是因为，随着温度的升高，生化反应的速率加快，但另一方面，核酸、 酶等功能物质的分子结构可能会受到不可逆破坏变性或失活，温度过低也同理.

图 5(c)所反映的为菌株H1在不同铁含量培养基中培养5 d后的锰氧化率.从中可看出，随着培养基中铁浓度增大，锰氧化率也增大，0.1~1.0 g ·L^-1增大趋势最明显，至1.0 g ·L^-1时，Mn²⁺的氧化率迅速长至58%，之后基本保持稳定.培养过程中还发现，1~2 d即产生大量红褐色絮状铁泥，而铁浓度为0的对照中锰氧化物出现的量少且较晚，说明菌株H1能够同时氧化铁和锰，且对铁的氧化能力强于锰.铁是铁锰氧化细菌重要的营养元素，参与代谢，保证铁锰氧化细菌具有高效而稳定的锰氧化能力，同时絮状铁泥对培养基中 Mn²⁺有较强的吸附等作用，加强了体系的除锰能力.

对于Mn(Ⅲ)是否在体系中起到关键作用，以往的研究有很多猜测和不同的研究结果.Johnson等^[29]在对1株海洋锰氧化菌Erythrobacter sp. SD21研究时发现Mn(Ⅲ)是酶促反应的初级产物，Webb等^[30]用焦磷酸捕捉到了Bacillus sp. SG-1氧化Mn(Ⅱ)的过程中瞬时Mn(Ⅲ)中间体的存在，Mn(Ⅱ)的氧化是一系列单电子传递过程.而Barbar等^[31]的研究却没有发现Mn(Ⅲ)的形成.本实验中用10 mmol ·L^-1焦磷酸钠捕捉菌株H1培养3 d后培养液中的Mn(Ⅲ)，样品的紫外扫描图[图 6(a)]显示，480 nm处有明显吸收峰，说明样品中有Mn(Ⅲ)与焦磷酸钠形成的络合物.培养液D480结果如图 6(b)所示，实验组(有菌有锰) 菌株H1经培养5 d D480显著增大，而对照组中D480的值很小且不随时间改变.说明菌体H1在氧化Mn(Ⅱ)的过程中有Mn(Ⅲ)中间体的产生.由此可推测，菌株H1首先在酶的催化作用下首先把Mn(Ⅱ)氧化成Mn(Ⅲ)，然后迅速发生歧化反应，生成Mn(Ⅱ)和Mn(Ⅳ).也可能菌株H1先将Mn(Ⅱ)氧化成Mn(Ⅲ)，再把Mn(Ⅲ)氧化成Mn(Ⅳ)是两个单电子传递过程，由两种不同的酶来催化，这个过程比两个电子同时传递所需的能量更低，因而Mn(Ⅱ)氧化活性更高.

图 6

Fig. 6

图 6 焦磷酸钠捕捉菌悬液中Mn(Ⅲ)的量 Fig. 6 Absorbance value of Mn(Ⅲ)-pyrophosphate in the bacterium suspension

对锰氧化活性因子的分布进行定位研究，各部分的锰氧化效果如图 7所示，有锰和无锰体系各部分对锰的氧化活性强弱表现出一致性，即菌株H1的培养液、 上清液、 菌体和细胞裂解液催化Mn²⁺氧化的活性由强到弱依次为：细胞裂解液<上清液<菌体<菌液，其中细胞裂解液活性远低于后三部分，而菌液、 菌体、 上清液的活性较高且相差不大，由此可推测菌株对Mn²⁺的氧化主要是菌株释放的锰氧化活性因子的作用结果.锰氧化活性因子在细胞内合成，后分泌到细胞外环境或菌体表面发生作用，且由于经Tris-HCl洗过的菌体仍有很高活性，可知锰氧化活性因子大部分先强烈吸附在细胞表面，再慢慢释放到溶液中.

图 7

Fig. 7

图 7 菌株H1锰氧化活性因子定位Fig. 7 Location of the Mn(Ⅱ) oxidation factor in strain H1

采用透射电镜能谱(SEM-EDX)、 X射线洐射(XRD)和X射线光电子能谱(XPS)分析对生成的生物氧化锰进行表征.

扫描电镜如图 8所示，无锰培养基中培养的H1菌体表面光滑[图 8(a)]，而含锰培养基中的H1菌体[图 8(b)]虽经多次洗涤，仍发现有大量的无定形不溶物紧密结合在细胞表面，该不溶物可能为被菌体吸附的Mn²⁺及氧化的生物氧化锰沉淀，与Tebo等^[1]报道一致.沉淀中可能还有大量的被菌H1氧化的铁氧化物，图 8(a)的EDX中元素分析证实了大量铁氧化物的存在.在收集的锰氧化物沉淀中，Mn含量为8.8%(质量分数)，占了较大比例，但Mn元素的吸收峰远小于铁元素(质量分数为33.5%)，再次证明铁是Aminobacter sp. H1的必需元素.另外氧元素的吸收峰仅次于铁，质量分数为32.74%，这可能是因为沉淀中有大量的细菌个体的缘故，细菌把锰和铁同时或分步氧化后吸附在细菌表面，铁锰氧化也相互胶结而难以分离.

图 8

Fig. 8

图 8 生物氧化锰的扫描电镜和能谱(SEM-EDX)图Fig. 8 SEM-EDX analysis of biogenic Mn oxide by strain H1

从生物氧化锰的XRD图谱[图 9(a)]可以看出，样品在2θ为24.138°、 31.082°、 37.131°、 37.243°处出现一系列特征峰，且衍射峰较尖锐，其对应的晶面间距和相对强度与XRD标准卡片及相关文献相吻合.可以确定Aminobacter sp. H1产生的生物锰氧化物成分较复杂，含有MnCO₃、 MnOOH、 Mn₃O₄和MnO₂等成分，由图谱中其他的尖锐峰可推断还存在其他物质.根据XPS图谱[图 9(b)]对生物氧化锰中锰元素的价态进行分析，Mn2p的结合能有2个主峰Mn2p_3/2和Mn2p_1/2，其中Mn2p_3/2谱峰不对称，Mn应该存在1种以上的化学状态，且对应的结合能分别为650.8 eV和638.7 eV，用污染碳C1s=281.8 eV校准后的峰值为653.5 eV和641.4 eV，为Mn(Ⅱ)和Mn(Ⅳ)的特征吸收峰，但未见Mn(Ⅲ)的吸收峰，可能由于Mn(Ⅲ)为中间体，存在时间较短，不稳定而不易捕捉.

(1)分离筛选出1株高效氧化Mn(Ⅱ)的菌株Aminobacter sp. H1，最佳条件下，锰耐受浓度可达50 mmol ·L^-1，可完全去除浓度低于10 mmol ·L^-1的Mn(Ⅱ).首先通过吸附作用大量去除培养基中的锰，然后再把吸附的锰氧化成生物氧化锰或作为自身生长所需要的营养元素.

(2)Aminobacter sp. H1对锰的氧化可能为酶促反应，受pH和温度影响显著，最适温度和pH分别为35℃、 7.0，Mn²⁺和Fe是Aminobacter sp.H1生长代谢的必需元素，氧化Mn(Ⅱ)的过程中发现有Mn(Ⅲ) 瞬时中间体产生.

(3)Aminobacter sp. H1主要通过产生锰氧化活性因子和释放碱性代谢产物提高体系pH两种方式来催化氧化Mn(Ⅱ).起氧化作用的物质在细胞内合成后再释放到胞外起作用，菌液、 细胞裂解液、 菌体和上清液均具有氧化Mn(Ⅱ)的活性，且表现为细胞裂解<液上清液<菌体<菌液.

(4)生物氧化锰的表征结果显示，生物氧化锰与菌体结合紧密，弱结晶、 无固定形态，其中铁含量较高，锰元素以MnCO₃、 MnOOH、 Mn₃O₄和MnO₂形态存在.