近年来，具有胞外传递电子能力的微生物聚集形成的电活性生物膜，因其独特的电子传递方式和在环境领域的巨大应用潜力，引起了广泛关注^{[1, 3]}. 自然环境中(例如海水沉积物、 土壤和各种废水中)的电活性生物膜的发现，已改变了人们对生物膜与微界面环境相互作用的认识. 传统上，生物膜主要利用吸附和代谢作用参与相关环境过程. 与传统生物膜相比，电活性生物膜(electroactive biofilms，EABs)的最大特点是能够将代谢有机物产生的电子直接或者间接传递给胞外电子受体^[3]，从而驱动一系列与环境密切相关的过程，例如重金属转化、 有机污染物降解和温室气体排放等^[4]. 固体电极、 矿物和有机污染物等都可以作为电活性生物膜胞外电子传递的受体^{[5, 6]}. 基于以上研究，电活性生物膜在清洁能源回收、 废水处理和环境污染物降解等领域已初步展现出巨大的应用潜力^[7].

此外，环境中的金属离子，例如Cr⁶⁺、 Fe³⁺等^{[8, 9]}，也可以作为电子受体直接接受电活性生物膜氧化有机物释放的电子，因而许多学者致力于电活性生物膜处理各种含重金属离子废水的研究. Tao等^[10]利用电活性生物膜构建的微生物燃料电池系统，使Cu²⁺在电池阴极接受电活性生物膜氧化有机物释放的电子，从而实现了铜离子的还原与回收. 利用相同的原理，Choi等^[11]在微生物燃料电池系统中对废水中的Au⁺进行还原，阴极接受电子将Au⁺还原，其还原效率高达99.89%. 金属离子的回收与利用方面的研究大多都是在微生物燃料电池系统中进行的，其具有质子膜价格昂贵、 反应器较复杂、 不利于放大应用等缺点^[12]. 近年来，研究发现电活性生物膜利用胞外电子传递的特点，可以直接驱动重金属的还原转化，Kalathil等^[13]发现电活性生物膜能够简单、 高效地合成高度分散的纳米银； 同时Bunge等^[14]发现利用电活性生物膜也可以将Pd²⁺还原成固态的Pd纳米颗粒； 电活性生物膜介导合成的金属和金属-半导体纳米复合材料有望为纳米材料的合成提供一种新途径，同时实现重金属的回收利用，比其他合成方法更加环保、 快速. 但是，电活性生物膜介导的重金属离子还原转化机制仍有待深入研究，特别是具有多价态的重金属离子的还原转化.

本研究利用电位控制方法在碳毡上形成了生物膜，采用循环伏安扫描(CV)探究了生物膜的电活性，采用扫描电镜(SEM)、 能谱分析仪(EDS)和X光电子能谱(XPS)探究了电活性生物膜介导Cu²⁺的还原转化情况. 研究发现，电活性生物膜能够利用乙酸作为电子供体，Cu²⁺作为电子受体，将Cu²⁺还原成单质铜或一价铜，从而达到Cu²⁺的还原转化并探讨其转化机制的目的, 以期为电活性生物膜介导环境中铜离子的形态转化和回收利用提供理论依据. 1 材料与方法 1.1 电活性生物膜的驯化

电活性生物膜的驯化是在电化学工作站提供恒电势的条件下进行操作^[15]，采用三电极体系：碳毡作为工作电极(2.0 cm×2.0 cm)，铂丝为辅助电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极. 设定工作电极的恒定电压为+0.1 V. 在电化学反应器中接入2.0 mL厌氧污泥(广州猎德污水处理厂)和18 mL乙酸钠(1 g ·L^-1)底物溶液，启动运行. 乙酸钠基底溶液成分组成^{[16, 17]}：NaH₂PO₄ ·2H₂ O (2.77 g ·L^-1)、 Na₂HPO₄ ·12H₂ O (11.40 g ·L^-1)、 NH₄Cl (0.31 g ·L^-1)、 KCl (0.13 g ·L^-1)、 维生素溶液(12.5 mL)和微量元素溶液(12.5 mL)，并加入CH₃COONa ·3H₂ O (1.66 g ·L^-1)作为电子供体. 所有的溶液经过高温湿热灭菌，反应体系运行前充氮气20 min，同时体系的温度控制在(30±1)℃. 1.2 数据的采集与分析方法

采用CHI660D电化学工作站(上海辰华仪器公司)，对三电极体系的生物电流进行记录. 当电活性生物膜驯化完成以后，利用循环伏安法(CV)对碳毡上的生物膜的电化学活性进行表征. 在其输出电流达到最高和最低时，选用扫描速率为5 mV ·s^-1对生物膜进行循环伏安法(CV)表征. 当生物膜的输出电流处于最低的状态下，分别选用不同的扫描速率(5、 10、 15、 20 mV ·s^-1)对其进行表征. 为了避免测量过程中干扰因素的存在，在输出电流最低时，CV表征时选用的电解质为不含乙酸钠、 维生素和微量元素的基底溶液. CV扫描范围为-0.8～0.2 V. 1.3 电活性生物膜还原铜的试验

用一定浓度的2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液替换磷酸缓冲液, 将pH调至5.7,避免pH偏低影响电活性生物膜的活性. 用MES缓冲液配制浓度为40 mg ·L^-1的CuSO₄溶液. 将驯化完成的电活性生物膜置于20 mL的西林瓶中，取15 mL含Cu²⁺的MES溶液，并在其中加入1 mL CH₃COONa ·3H₂ O (1.66 g ·L^-1)，同时保持整个反应体系处于严格的厌氧状态，将其静置. 1.4 还原铜的扫描电镜和光电子能谱表征

将与Cu²⁺发生还原反应后的电活性生物膜用2.5%戊二醛(GTA)固定4 h，再用20%、 30%、 50%、 70%的乙醇进行梯度脱水，进一步对样品进行真空临界干燥，通过对样品喷金增加其导电性，将样品置于扫描电子显微镜(SEM，JSM-6330F，Hitachi)上进行观察. 采用扫描电子显微镜观察电活性生物膜表面形貌，并用能谱分析仪(EDS)对其进行元素成分探测，加速电压为20 kV. 取真空干燥的样品用光电子能谱仪(XPS，ESCALAB 250, Thermo Fisher Scientific)对其表面的元素组分进行价态分析. 其中, X射线源采用单色AlKα射线,分析室真空度为～2×10^-9 mbar, 荷电效应引起的结合能偏差通过样品表面污染C1s峰(284.8 eV)进行校正. 1.5 Cu²⁺对电活性生物的毒性测试

采用激光共聚焦显微镜(LSCM，LSM 710，Carl Zeiss)，测试Cu²⁺对生物膜的毒性^[18]. 生物膜用荧光染色试剂盒(L7012)染色^[19]，具体方法如下：取染色剂SYT09及PI以3 mL ∶1 mL的比例溶于0.9%生理盐水，4℃避光保存备用，使用前充分振荡. 将附着生物膜的碳毡用2 mL 0.9%生理盐水轻轻洗涤3次，将其置于上述染料溶液中，暗室常温下静置12 min，再用上述同样的溶剂洗涤2~3次，将碳毡固定在载玻片上. 将载玻片置于激光共聚焦显微镜的载物台上，对样品进行观察.

2 结果与讨论 2.1 生物膜的电化学活性表征

图1(a)是利用恒电位法驯化电活性生物膜的电流-时间曲线图，在+0.1 V(vs. SCE)恒电位条件下，生物电化学系统产生的电流会随时间逐渐增高，呈现很好的周期性变化. 经过数个周期后，生物电流达到稳定值，说明此时电活性生物膜趋于成熟. 驯化完成后，循环伏安法(CV)进一步表征了生物膜的电化学活性和电子转移过程. 如图1(b)所示，在5 mV ·s^-1扫描速率下，黑色曲线表示输出电流达到最大时测量的CV图谱，通过图谱可以观察到生物膜上细菌正在催化乙酸的氧化； 红色曲线表示在输出电流最低(乙酸盐营养液耗尽)的情况下扫描的CV图谱，CV曲线上出现两对氧化还原峰，其电位分别出现在-0.34 V和-0.48 V. 随着扫描速率的增加[图1(b)]，这两对氧化还原峰的电流随之增大，峰电流密度与扫描速率的平方根呈现很好的相关性(R2>0.999)，符合电活性物质表面控制模型^[20]，表明这两对氧化还原峰均来自于固定在电极表面上的生物膜. 电活性生物膜的CV图谱与Geobacter sulfurreducens生物膜CV图谱非常相似^[21]，表明CV图谱的氧化还原峰主要来自于电活性生物膜中含有的地杆菌类微生物.

图1

Fig. 1

图1 驯化阶段电活性生物膜的电流-时间曲线和驯化结束后电活性生物膜的循环伏安图 Fig.1 Current-time curve of the electroactive biofilms during its domestication stage and cyclic voltammograms (CVs) of the electroactive biofilms in the absence or presence of sodium acetate at a scan rate of 5 mV ·s-1 after domestication 图 (b)的扫速为5 mV ·s-1，其中插图是不同扫速的循环伏安图

采用扫描电子显微镜(SEM)对电活性生物膜还原Cu²⁺的变化进行表征. 如图 2(a)所示，许多杆状微生物附着在碳纤维表面. 铜被还原以后，生物膜的形貌发生了显著变化，可以明显观察到碳纤维上主要分布了许多规则的球状颗粒； 在更大放大倍数下，可以清晰地观察到大量微生物包裹在球状颗粒中，并且微生物主要分布在球状颗粒的孔隙中，密集生长. 我们预测球状颗粒为电活性生物膜介导Cu²⁺还原的产物. 为确定生物膜上球状颗粒主要成分，本研究进行了SEM-EDS分析. 如图 3(a)和表1所示，球状颗粒含有的主要成份是C、 O两种元素，其含量分别为40.83%和49.94%，说明球状颗粒主要是生物有机体； 同时能谱图上有明显的Cu峰，其含量达到9.14%. 为了进一步探究电活性生物膜上铜元素的化学价态，运用光电子能谱仪(XPS)进行分析[图 3(b)]，发现在结合能为932.5 eV 和933.8 eV位置存在两个峰，对应于Cu2p3/2. 这与前人研究的CuO和Cu₂O XPS峰值^[22]一致，可以确定电活性生物膜上有CuO和Cu₂O的存在，而没有出现单质铜. 根据铜还原的热力学参数，在电活性生物膜作用下Cu²⁺可以完全还原成单质铜，但是在XPS分析的操作检测过程中，我们无法保证绝对的厌氧条件，单质铜又极容易被氧化成CuO或Cu₂O，所以可以推断氧化铜的产生主要源自于单质铜的氧化. 总之，通过XPS分析检测到亚铜的产生，说明电活性生物膜能够介导Cu²⁺还原，还原产物有可能是Cu⁺或者Cu.

图2

Fig. 2

图 2 对照组和试验组电活性生物膜的电镜照片 Fig.2 Scanning electron micrographs (SEMs) of the electroactive biofilms before and after the addition of Cu2+

图3

Fig. 3

图 3 电活性生物膜的EDS和XPS图谱 Fig.3 EDS and XPS spectra of the electroactive biofilms

表1(Table 1)

表1 电活性生物膜表面的球状颗粒的EDS成分分析结果 Table 1 EDS analysis of the spherical particles in the electroactive biofilms 元素 质量百分比/％ 原子百分比/％ C 40.83 50.98 O 49.94 46.82 S 0.08 0.04 Cu 9.14 2.16 总量 100

表1 电活性生物膜表面的球状颗粒的EDS成分分析结果 Table 1 EDS analysis of the spherical particles in the electroactive biofilms

本研究采用了循环伏安扫描(CV)来探究电活性生物膜介导Cu²⁺的还原过程. 如图4(a)所示，在底物耗尽情况下，电活性生物膜在-0.20～-0.60 V之间出现两对对称的氧化还原峰，但是在铜离子存在时，这两对峰发生了明显改变，并在-0.183～-0.095 V处出现了一对新的氧化还原峰，根据文献报道，这对新的峰是Cu²⁺的氧化还原峰^[23]. 通过图4(a)可以发现Cu²⁺的还原电位高于生物膜上电活性物质的氧化峰电位，说明Cu²⁺在热力学上可以被生物膜上的电活性物质还原. Mathis等^[24]的研究表明，电活性微生物可以通过膜结合氧化还原蛋白将电子传递给Cu²⁺，类似氧化铁被还原. 铜还原的过程如图4(b)所示：电活性生物膜氧化乙酸产生电子，电活性生物膜上的微生物通过膜结合蛋白^[25]、 纳米导线^[26]等方式将电子传递给Cu²⁺，将其还原成Cu⁺或者Cu.

图4

Fig. 4

图4 电活性生物膜与Cu2+反应前后的循环伏安和电活性生物膜还原Cu2+的反应机制 Fig.4 Cyclic voltammograms of the electroactive biofilms before and after Cu2+ addition and the proposed reduction reaction mechanism of Cu2+ by the electroactive biofilms

Cu²⁺对微生物具有一定毒性，过高浓度的Cu²⁺将抑制微生物体内相关酶类的活性并且对细胞膜的结构和细胞功能造成损伤, Cu²⁺可通过破坏细胞膜或者抑制细胞分裂导致微生物生长和繁殖异常、 生物体畸变甚至死亡^[27]. 本研究采用了两种方式对Cu²⁺的毒性范围进行探索，第一种方式是通过生物电流的变化来判断Cu²⁺对电活性生物膜的毒性. 电活性生物膜氧化乙酸产生生物电流值可达0.52 mA，该电活性生物膜经不含乙酸的20 mg ·L^-1 Cu²⁺溶液处理后，重新氧化乙酸的输出电流无显著变化，仍可达到0.52 mA左右.

图5

Fig. 5

图5 电活性生物膜微生物激光扫描共聚焦显微分析 Fig.5 Laser scanning confocal micrographs (LSCMs) of the microbes on the electroactive biofilms

电化学方法富集形成电活性生物膜，采用循环伏安法对电活性生物膜的电化学活性进行表征. 电活性生物膜能够有效催化乙酸氧化，并将电子传递给电极，说明形成的电活性生物膜具有良好的电化学活性. 对置于含Cu²⁺溶液中的生物膜进行表征，发现在生物膜上形成了许多规则的球状颗粒，EDS半定量分析其主要成分是C、 O和Cu元素，其中铜含量达9.14%. 采用光电子能谱(XPS)对Cu元素的化合价态进行了鉴别，结果显示CuO和Cu₂O的存在. LSCM检测发现，在乙酸存在的条件下，Cu²⁺对生物膜的毒性显著降低. 这些结果表明，电活性生物膜能够利用乙酸作为电子供体介导Cu²⁺还原. 为电活性生物膜应用于环境中铜离子的固定和回收提供了理论依据.