六氯苯是联合国环境规划署国际公约中首批控制的12种持久性有机污染物(POPs)之一^[1]，在杀虫剂、 杀菌剂、 合成橡胶助剂、 木材防腐剂、 有机合成化工原料的生产，石墨阳极的处理，军事烟雾的生产以及铝或其他金属制造过程中都会产生^[2].

六氯苯具有长期残留性、 生物蓄积性、 难溶于水等特点，广泛分布在空气、 水、 土壤以及沉积物中^[3,4,5,6].由于性质稳定难以自然降解^[7]，土壤中存在的六氯苯不仅破坏了植被的自然生长，而且容易造成地下水水质的恶化，更重要的是污染土壤中的六氯苯能够通过直接摄入、 皮肤接触及吸入土壤尘等方式侵入人体，并在人体内富积，给人体健康造成严重的危害^{[8, 9]}.已有研究证实，六氯苯具有累积性慢性或亚慢性毒性作用，能够导致生物体内分泌紊乱、 生殖及免疫机能失调、 神经行为和发育紊乱以及癌症等疾病^{[10, 11]}，因而已被纳入环境内分泌干扰物之列.因此，六氯苯的环境污染已经成为制约城市可持续发展的世界性环境问题，而针对六氯苯污染土壤的修复研究也已上升为国内外土壤污染防治领域的重要研究课题和热点问题之一.

目前，国内外大多数专家学者在六氯苯污染土壤修复治理方面的研究主要集中在物理法和化学法^{[12,13,14,15,16,17]}两个方面，但是这两种方法终因存在处理成本高、 易产生二次污染、 工程可行性差等缺点，未得到更广泛的应用.而以厌氧降解为代表的生物法因其投资少、 操作简单、 对周围环境影响小且不产生二次污染等优点^[18]，在降解和转化六氯苯方面表现出了巨大的潜力^[19]，已逐渐成为国内外污染土壤修复技术研发的前沿和热点.但是，实际六氯苯污染土壤中往往共存多种低氯苯类同系物，在厌氧降解过程中，由于氯苯类同系物之间的相互作用^{[20, 21]}，六氯苯的降解活性通常会受到影响.

本研究分析了不同环境条件下，污染土壤中氯苯类同系物的累积规律以及对六氯苯厌氧降解率的影响.实验采用水淹法营造厌氧环境，以乙酸作为碳源，考察了在初始pH值、 反应温度、 固液比等不同环境条件下，3种共存氯苯类同系物五氯苯、 1,2,4,5-四氯苯、 1,2,4-三氯苯的累积规律及对六氯苯厌氧降解活性的影响，以期通过本研究为六氯苯实际污染土壤厌氧降解工艺的研发及工程设计，并最终为提高六氯苯的厌氧降解率提供可靠的借鉴.

1 材料与方法 1.1 实验原料与化学试剂

实验所用土样取自北京某染料厂长期受六氯苯污染的土壤，六氯苯作为染料生产的中间体在土壤中存留三十余年.土样经研磨、 过筛后，用自封袋密封放置于冰箱中，于4℃下保存.染料厂污染土壤中氯苯类同系物的含量及其理化性质见表1.

表1(Table 1)

表1 污染土壤中氯苯类同系物的含量及其理化性质 1) Table 1 Contents and physicochemical characteristics of chlorobenzenes in the dye plant contaminated soil 项目 六氯苯 五氯苯 1,2,4,5-四氯苯 1,2,4-三氯苯 c/mg·kg-1 2.00~2.80 0.10~0.35 0.14~0.49 0.25~0.90 M/g·mol-1 284.8 250.3 215.9 181.5 P*/Pa 0.0025 0.22 0.72 38.02 Kiaw 0.036 0.034 0.050 0.093 Csatiw(g/100 g水)×10-6 0.028 2.630 5.888 165.959 1)c为各氯苯在土壤中的含量范围； M为摩尔浓度；P*为蒸气压； Kiaw为空气-水分配常数； Csatiw为溶解度

表1 污染土壤中氯苯类同系物的含量及其理化性质 1) Table 1 Contents and physicochemical characteristics of chlorobenzenes in the dye plant contaminated soil

化学试剂：乙酸(分析纯)、 无水硫酸钠(分析纯)、 氢氧化钠(分析纯)、 硫酸(分析纯)、 二氯甲烷(农残级)、 丙酮(农残级). 1.2 实验设备

生化培养箱(HPS-250，中国哈东联公司)，雷磁pH计(PHSJ-4A，中国盛磁公司)，平行蒸发仪(Syncore Analyst R-6，瑞士BUCHI公司)，氮吹仪(HGC-12A，英国STUART公司)，气相色谱质谱联用仪(ITQ 1100，美国热电公司)，气相色谱仪(TRACE GC ULTRA，美国热电公司)，质谱检测仪(DSQⅡ，美国热电公司)，自动进样器(AS3000 GC-MS，美国热电公司)，超声振荡器(DL-180D，上海之信仪器公司)，恒温水浴振荡器(HZS-HA，中国哈东联公司). 1.3 实验步骤

(1) 将污染土壤过孔径为2 mm的筛2次，确保土壤充分混合.

(2) 取200 g过筛后的污染土壤样品，置于500 mL棕色广口瓶中，按照一定固液比向其中加入一定体积的去离子水，同时加入0.8 g乙酸，形成淹水厌氧环境.

(3) 使用硫酸和氢氧化钠调节反应体系的初始pH值.

(4) 调好反应体系的初始pH值后，将棕色广口瓶用凡士林密封后放入生化培养箱中，在设定温度下进行厌氧降解反应实验，反应时间为33 d.

(5) 反应结束后，使用抽滤装置将悬浊液进行固液分离，泥样及水样中的含氯有机物采用气相色谱质谱联用仪进行分析检测.

(6) 实验过程中，为确保实验数据的准确性，减少实验误差，每组实验均做3个平行样.

(7) 对于初始pH值的影响实验，反应温度恒定为45℃，固液比恒定为1 ∶1(g ∶mL)，实验在初始pH值分别为4、 5、 7、 9的条件下进行； 对于反应温度的影响实验，初始pH值恒定为5，固液比恒定为1 ∶1(g ∶mL)，实验在反应温度分别为25、 35、 45和55℃的条件下进行； 对于固液比的影响实验，初始pH值恒定为5，反应温度恒定为45℃，实验在固液比分别为1 ∶1、 1 ∶1.5和1 ∶2(g ∶mL)的条件下进行. 1.4 分析方法 1.4.1 泥样分析

(1) 称取样品.称取质量为(20±0.05) g的泥样至250 mL肖特瓶中. (2) 去除水分.将泥样与20 g无水硫酸钠充分混合，以除去泥样中的水分.如有必要，可适当增加无水硫酸钠的用量.

(3) 振荡萃取.向去除水分的待测样品及其质控样、 空白样中均加入100 mL体积比为1 ∶1的二氯甲烷/丙酮溶液，然后将样品置于超声振荡器中振荡萃取2 h.

(4) 过滤分离.将振荡萃取后的样品移至过滤漏斗中，进行萃取液与样品的分离.过滤漏斗下端填上玻璃棉堵住漏斗的滤孔，以避免细颗粒泥样随萃取液流下.萃取液过滤至浓缩杯中后，再用二氯甲烷润洗漏斗，润洗液也转移至浓缩杯中.

(5) 蒸发.将浓缩杯放至平行蒸发仪中.平行蒸发仪的参数设定为：冷凝水温度为0℃，水浴温度为55℃，顶盖温度为60℃，转速为150 r ·min^-1，真空度为480 mbar.蒸发30 min后，将真空度调至400 mbar继续蒸发30 min，再将真空度调至350 mbar，直至有机溶剂浓缩至约1~2 mL.

(6) 浓缩.将蒸发后的有机溶剂移至氮吹仪中继续对样品进行浓缩.当溶液浓缩至1 mL以下时，用二氯甲烷定容到1 mL.用250 μL的微量注射器移取200 μL样品至400 μL内插管中，同时加入5 μL浓度为200 μg ·mL^-1的SVOC内标.

(7) 测定.将样品置于气相色谱质谱联用仪中进行六氯苯及其氯苯类同系物的浓度测定.

气相色谱仪工作条件：初始温度 40℃，保持4 min，以 10℃ ·min^-1的速度升至160℃，保持1 min，以 10℃ ·min^-1的速度升至280℃，保持4 min，以 10℃ ·min^-1的速度升至300℃，保持5 min，色谱柱流量 (氦气)1.5mL ·min^-1，进样口温度270℃，进样体积为1 μL，进样方式为不分流进样.

质谱仪条件：质量范围为35~500 u，离子源温度为275℃，四级杆温度为150℃.

(8) 计算.样品中六氯苯及其氯苯类同系物浓度的计算见式(1)和(2).m=c×V/M (1)式中，m为土壤样品中氯苯的浓度(mg ·kg^-1)；c为有机溶剂中氯苯的浓度(mg ·L^-1)；V为有机溶剂的体积(L)；M为土壤样品的干重(kg).y=(m₁-m₂)/m₁ (2)式中，y为氯苯的降解率(%)； m1为反应前土壤样品中氯苯的浓度(mg ·kg^-1)； m2为反应后土壤样品中氯苯的浓度(mg ·kg^-1). 1.4.2 水样分析

(1) 量取样品.量取100 mL水样置于200 mL分液漏斗中.

(2) 振荡萃取.向分液漏斗中加入6 mL二氯甲烷，并将分液漏斗置于恒温水浴振荡器中振荡萃取20 min.

(3) 液液分离.振荡结束后，将分液漏斗取出，静置5 min，将下层的二氯甲烷转移至浓缩杯中.重复步骤(2)和(3)两次.

(4) 分析检测.水样中六氯苯及其氯苯类同系物的浓度检测同1.4.1节中的(5)～(7). 1.5 回收率

为减少实验误差，确保实验检测数据的准确性，对采用内标法所得的4种氯苯的回收率进行了实验，见表2 . 从中可知，无论是六氯苯及氯苯同系物的单一回收率还是平均回收率均在90%~125%之间，说明该分析方法具有较好的可行性.

表2(Table 2)

表2 4种氯苯的回收率 /% Table 2 Recovery rate of four kinds of chlorobenzenes/% 氯苯 检测限/mg·L-1 回收率/% 1 2 3 平均 六氯苯 0.01 104 94.4 117 105.1 五氯苯 0.01 97 92.8 119 102.9 1,2,4,5-四氯苯 0.01 98.4 90.8 124 104.4 1,2,4-三氯苯 0.01 97.4 108 107 104.1

表2 4种氯苯的回收率 /% Table 2 Recovery rate of four kinds of chlorobenzenes/%

本研究采用SPSS 19.0 for windows 软件对实验数据进行了处理，分析了不同初始pH值、 反应温度及固液比条件下，六氯苯降解率实验数据之间的显著性差异，并通过多元线性回归分析探讨了影响六氯苯降解率的主要因素.

2 结果与讨论 2.1 不同初始pH值条件下的累积影响

不同初始pH值条件下，3种共存氯苯类同系物五氯苯、 1,2,4,5-四氯苯、 1,2,4-三氯苯的累积规律及对六氯苯降解率的影响结果见图1，六氯苯降解率差异显著性见表3.

图1

Fig. 1

图1 不同初始pH值条件下共存氯代物的累积规律对六氯苯降解率的影响 Fig.1 Effects of accumulation of chlorobenzene homologue on degradation of hexachlorobenzene under different initial pH values

表3(Table 3)

表3 不同初始pH值条件下六氯苯降解率的差异显著度F值和P值 1) Table 3 The F value and P value of significant difference of degradation of hexachlorobenzene under different initial pH values 项目 反应时间/d 3 8 13 18 23 28 33 F 92.935 12.903 43.135 66.019 44.420 70.880 44.265 P 0.000 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 1)P<0.05，表示六氯苯降解率在不同初始pH值条件下存在显著差异

表3 不同初始pH值条件下六氯苯降解率的差异显著度F值和P值 1) Table 3 The F value and P value of significant difference of degradation of hexachlorobenzene under different initial pH values

从图1不难看出，六氯苯的厌氧降解率随着初始pH值的升高呈现先升高后降低的趋势.而表3显示，六氯苯的降解率在不同初始pH值条件下的差异显著，也印证了六氯苯降解率的这一变化规律，即在酸性及碱性反应条件下，六氯苯的降解率较低，而在弱酸性及中性反应条件下，六氯苯的降解率相对较高，尤其是在弱酸性反应条件下(初始pH=5)，反应33 d的降解率更是达到了58.18%.

实验同时发现，在不同的反应初始pH值条件下，五氯苯和1,2,4,5-四氯苯表现出相同的累积规律，即土壤中浓度的累积均出现在酸性及碱性反应条件下，且最大累积浓度出现在降解第18 d.当初始pH=4时，五氯苯和1,2,4,5-四氯苯的浓度分别从0.24mg ·kg^-1和0.18 mg ·kg^-1增加至0.27 mg ·kg^-1和0.19 mg ·kg^-1，增幅分别达12.5%和5.6%.当初始pH=9时，五氯苯和1,2,4,5-四氯苯的浓度分别从0.24mg ·kg^-1和0.18mg ·kg^-1增加至0.25mg ·kg^-1和0.2mg ·kg^-1，增幅分别达4.2%和11.1%.而在弱酸性(初始pH=5)及中性(初始pH=7)反应条件下，五氯苯和1,2,4,5-四氯苯在整个降解实验周期内未出现浓度累积.在六氯苯厌氧降解过程中，1,2,4-三氯苯在酸性及弱酸性条件下未出现浓度累积，在中性条件下开始出现浓度累积，且累积程度随初始pH值升高而增加，尤其是当初始pH值为9时，1,2,4-三氯苯从初始浓度0.66 mg ·kg^-1增加至0.78 mg ·kg^-1，增幅达到18.2%.

已经有研究表明，六氯苯在厌氧降解过程中是逐级脱氯的，即六氯苯的厌氧降解过程是一个从高氯代苯逐渐转变为低氯代苯的过程^[22,23,24].同时，在降解过程中，中间代谢产物的累积能够对微生物的代谢活动产生反馈抑制作用^{[25,26,27,28]}.所谓反馈抑制作用，即以代谢产物作为变构剂来抑制此产物合成过程中的某种酶活性的作用，中间代谢产物的累积也会对微生物的代谢活动形成抑制作用.因此，在初始pH值为4的反应条件下，六氯苯的降解率较低的原因可能是五氯苯和1,2,4,5-四氯苯在整个降解周期内均出现了不同程度的累积导致，而且由于五氯苯的累积程度较高，对六氯苯降解的反馈抑制作用更加突出；相似地，在初始pH值为9的反应条件下，3种共存氯苯类同系物在整个降解周期内均出现了不同程度的累积，由于1,2,4-三氯苯的累积程度最大，因而在整个降解过程中的反馈抑制作用更加明显，这也导致了在该反应条件下六氯苯的降解率较低.

此外，实验采用多元回归分析，通过建立初始pH值、 五氯苯浓度、 四氯苯浓度及三氯苯浓度4个影响因素对六氯苯降解率的回归方程，探寻了影响六氯苯降解率的主要因素，逐步回归的分析结果见表4.从中可以看出，逐步回归方程中只有五氯苯浓度1个变量入选，其余3个影响因素均被排除.由此可以推断，在改变初始pH值的实验条件下，五氯苯浓度是影响六氯苯降解率的主要因素.

表4(Table 4)

表4 降解率和各影响因素的回归方程 Table 4 Stepwise multiple regression between degradation of hexachlorobenzene and environmental factors under different initial pH values 逐步回归方程 R F 六氯苯降解率=63.812-117.903×五氯苯浓度 0.959 23.132

表4 降解率和各影响因素的回归方程 Table 4 Stepwise multiple regression between degradation of hexachlorobenzene and environmental factors under different initial pH values

不同反应温度条件下，3种共存氯苯类同系物五氯苯、 1,2,4,5-四氯苯、 1,2,4-三氯苯的累积规律及对六氯苯降解率的影响结果见图2，六氯苯降解率差异显著性见表5。

图2

Fig. 2

图2 不同反应温度条件下共存氯代物的累积规律对六氯苯降解率的影响 Fig.2 Effects of accumulation of chlorobenzene homologue on degradation of hexachlorobenzene under different reaction temperatures

表5(Table 5)

表5 不同反应温度条件下六氯苯降解率的差异显著度F值和P值 1) Table 5 The F value and P value of significant difference of degradation of hexachlorobenzene under different reaction temperatures 项目 反应时间/d 3 8 13 18 23 28 33 F 140.296 36.249 104.392 72.289 99.282 48.932 69.122 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 1)P<0.05，表示六氯苯降解率在不同反应温度条件下存在显著差异

表5 不同反应温度条件下六氯苯降解率的差异显著度F值和P值 1) Table 5 The F value and P value of significant difference of degradation of hexachlorobenzene under different reaction temperatures

图2的实验结果同时显示，当反应温度在25~55℃的范围变化时，五氯苯在污染土壤中的累积程度呈现出先减少后增加的规律，当反应温度为45℃时，五氯苯在整个六氯苯的降解实验周期内未出现累积，在反应温度为25℃的条件下，五氯苯的累积程度最大，浓度由最初的0.24 mg ·kg^-1增加至0.33 mg ·kg^-1，增幅为37.5%.1,2,4,5-四氯苯的累积仅出现在温度较高的反应条件下，即在反应温度55℃的条件下，降解第18 d出现了累积，其浓度由最初的0.18 mg ·kg^-1增至0.2 mg ·kg^-1，增幅为11.1%.而在其他反应温度条件下，实验并未观察到1,2,4,5-四氯苯的累积现象.1,2,4-三氯苯在污染土壤中的累积程度是随反应温度的升高呈现先减少后增加的规律，即较低温度和较高温度条件下出现了不同程度的累积，而在适中温度35℃和45℃的条件下未出现累积现象.其中，在较高反应温度条件下(反应温度为55℃时)，累积现象尤为明显，在六氯苯厌氧降解的第18 d，1,2,4-三氯苯在污染土壤中的浓度由0.66 mg ·kg^-1增加至0.88 mg ·kg^-1，增幅达到33.3%.

因此，可以推断在常温(25℃)反应条件下，五氯苯和1,2,4-三氯苯在污染土壤中的累积可能是造成六氯苯降解率低的主要原因，其中五氯苯较高的累积程度使降解过程中的反馈抑制作用更加突出.而在较高的反应温度(55℃)条件下，六氯苯的降解率更低可能是由于3种共存氯苯类同系物在降解过程中同时出现累积所致，尤其以1,2,4-三氯苯的累积程度最高，对降解过程中反馈抑制作用的贡献最大.

此外，实验采用多元回归分析，通过建立反应温度、 五氯苯浓度、 四氯苯浓度及三氯苯浓度这4个影响因素对六氯苯降解率的回归方程，探寻了影响六氯苯降解率的主要因素，逐步回归的分析结果见表6 .从中可以看出，逐步回归方程中只有三氯苯浓度1个变量入选，其余3个影响因素均被排除.由此可以推断，在改变反应温度的实验条件下，三氯苯浓度是影响六氯苯降解率的主要因素.

表6(Table 6)

表6 降解率和各影响因素的回归方程 Table 6 Stepwise multiple regression between degradation of hexachlorobenzene and environmental factors under different reaction temperatures 逐步回归方程 R F 六氯苯降解率=159.355-176.444×三氯苯浓度 0.990 96.647

表6 降解率和各影响因素的回归方程 Table 6 Stepwise multiple regression between degradation of hexachlorobenzene and environmental factors under different reaction temperatures

不同固液比条件下，3种共存氯苯类同系物五氯苯、 1,2,4,5-四氯苯、 1,2,4-三氯苯的累积规律及对六氯苯降解率的影响结果见图3，六氯苯降解率差异显著性见表7.

图3

Fig. 3

图3不同固液比条件下共存氯代物的累积规律对六氯苯降解率的影响 Fig.3 Effects of accumulation of chlorobenzene homologue on degradation of hexachlorobenzene under different solid-liquid ratios

表7(Table 7)

表7 不同固液比条件下六氯苯降解率的差异显著度F值和P值 1) Table 7 The F value and P value of significant difference of degradation of hexachlorobenzene under different solid-liquid ratios 项目 反应时间/d 3 8 13 18 23 28 33 F 30.261 36.451 21.366 74.085 43.663 54.445 34.834 P 0.001 0.002 0.002 0.000 0.000 0.000 0.000 1)P<0.05，表示六氯苯降解率在不同固液比条件下存在显著差异

表7 不同固液比条件下六氯苯降解率的差异显著度F值和P值 1) Table 7 The F value and P value of significant difference of degradation of hexachlorobenzene under different solid-liquid ratios

由图3可知，六氯苯的厌氧降解率随固液比的减小而减小.表7同时显示，六氯苯的降解率在不同固液比条件下的显著差异，这也印证了上述六氯苯降解率的变化规律，即在固液比为1 ∶1时，在整个降解实验周期内六氯苯的降解率最大，接近60%.

此外，五氯苯、1,2,4,5-四氯苯和1,2,4-三氯苯在厌氧降解过程中呈现出相似的累积规律(见图3)，即累积程度均是随着固液比的减小而增加的.在固液比为1∶1的条件下，3种共存氯苯类同系物在整个降解实验周期内均未出现累积，在固液比为1∶2的条件下，3种共存氯苯类同系物分别出现了不同程度的累积，在降解第18 d，初始浓度分别由0.24、0.18和0.66 mg ·kg^-1增加至0.28、0.2和0.69 mg ·kg^-1，增幅分别为16.7%、 11.1%和4.5%.

很明显，固液比越小，3种共存氯苯类同系物在污染土壤中的累积程度越大，六氯苯的降解率越小.在3种共存氯苯类同系物中，以五氯苯的累积程度最大，因而在对六氯苯的反馈抑制作用中产生的影响也最大.

此外，实验采用多元回归分析，通过建立固液比、 五氯苯浓度、 四氯苯浓度及三氯苯浓度这4个影响因素对六氯苯降解率的回归方程，探寻了影响六氯苯降解率的主要因素，逐步回归的分析结果见表8.从中可以看出，逐步回归方程中只有五氯苯浓度1个变量入选，其余3个影响因素均被排除.由此可以推断，在改变固液比的实验条件下，五氯苯浓度是影响六氯苯降解率的主要因素.

表8(Table 8)

表8 降解率和各影响因素的回归方程 Table 8 Stepwise multiple regression between degradation of hexachlorobenzene and environmental factors under different solid-liquid ratios 逐步回归方程 R F 六氯苯降解率=80.765-170.807×五氯苯浓度 0.996 2859.912

表8 降解率和各影响因素的回归方程 Table 8 Stepwise multiple regression between degradation of hexachlorobenzene and environmental factors under different solid-liquid ratios

(1)在实际六氯苯污染土壤的厌氧降解过程中，共存氯苯类同系物的累积影响了六氯苯的降解活性，且这种以反馈抑制作用为特点的影响因外界环境条件的不同而不同.五氯苯在酸性、常温及低固液比的反应条件下，对六氯苯降解活性的影响较大，而1,2,4-三氯苯在碱性及高温反应条件下，对六氯苯降解活性的影响较大.

(2)根据共存氯苯类同系物在不同外界环境条件下呈现出的累积规律，采取针对性的提高氯苯类同系物降解率的措施，以进一步提高实际污染土壤中六氯苯的降解率，不失为实际六氯苯污染土壤修复治理技术研发以及工程设计的一种好选择.