沉积物向水体释放污染物，是造成水体污染的主要途径之一.大量污染物自流域进入集水区后，大部分将蓄积于沉积物中，并在一定的条件下释放进入水体，造成水体的内源性污染^[1,2].近年来，随着外源污染治理力度的加大，内源污染的强度呈现增加的趋势，尤其是内源磷污染备受关注.磷是湖泊富营养化的主要限制性因子，对水体营养状态和生态系统结构发挥十分关键的调控作用^{[2, 3, 4]}.已有研究发现，很多浅水富营养化湖泊都会发生高强度的内源磷污染，造成水体富营养化治理效果出现滞后的现象^[5,6].目前，普遍认为沉积物铁是控制内源磷释放的关键因子之一,在缺氧或厌氧条件下，氧化铁被还原，造成铁结合态磷向沉积物间隙水中释放和向上迁移，从而形成内源磷污染^{[7, 8, 9, 10]}.围绕沉积物磷铁响应关系开展工作，对于阐明内源磷污染发生过程与形成机制将发挥重要的作用.

准确获取间隙水中溶解态磷和铁的含量分布信息，可为评价内源磷污染水平和研究污染发生机制提供重要信息.对间隙水样品的获取一般采用主动破坏式的方法，即收集沉积物后，通过离心或压榨获取间隙水样品^[11,12].由于厌氧沉积物暴露空气后极易被氧化，该方式难以准确真实获取间隙水磷铁的含量信息，因此发展原位采样技术十分必要.已有原位采样技术包括间隙水扩散平衡技术(Peeper)^[13,14]、 薄膜扩散平衡技术(DET)^{[15, 16, 17]}、 根际溶液采样技术(Rhizon)^[18]等.最近发展的高分辨Peeper(HR-Peeper),在沉积物中仅需要平衡1~2 d，间隙水垂向空间分辨率达到2 mm^[19],满足了高时空分辨信息的获取要求.通过HR-Peeper获得的间隙水样品数量多，且每个间隙水样品的体积仅有15 μL，远远低于磷铁常规比色分析所需要的体积(1 mL左右)，给间隙水样品的分析带来较大的挑战.

微量比色技术(通常配合使用96微孔板与384微孔板)多用于生物细胞和蛋白质的测定，有关磷的测定国外学者已有研究，Telli等^[28]用96孔微量比色法研究了植物根系钙结合态磷的细胞毒性，Angelo等^[29]基于96微量比色技术快速、 微量测定了水体和土壤中磷含量.384微孔板相比于96孔具有体积更加微量的特点，Onoue等^[30,31]使用384微孔板作为测定手段进行药物风险的评估与生物光化学研究.目前384微量技术的应用大多在生物、 医药方面，对于化学元素的测定应用不多.本研究利用384微孔板微量比色技术，发展了一种大批量分析微量间隙水样品中溶解态磷和铁含量的方法，并考察了显色剂组成、 显色时间、 显色温度和方式等对微量测定的影响，在此基础上对各技术参数进行了优化，建立了完整的分析程序.将该方法与HR-Peeper装置结合，原位获取了太湖沉积物垂向剖面间隙水中溶解态反应性磷(DRP)和溶解态铁(Ⅱ)的含量分布信息.

DRP的测定采用磷钼蓝比色法^[19,22]，即在酸性条件下，正磷酸盐与钼酸铵、 酒石酸锑氧钾反应，生成磷钼杂多酸，被抗坏血酸还原后变成蓝色络合物即磷钼蓝，在波长700 nm处测定其吸光值.溶解态铁(Fe²⁺)测定采用邻菲啰啉比色法^[19,22]，即亚铁离子在pH 3~9时与邻菲啰啉生成稳定的橙红色络合物，在波长520 nm处测定其吸光值.

Epoch微孔板分光光度计(BioTek，USA)、 384微孔板(24×16，上海精睿生物科技有限公司)、 QB-9006恒温微孔板快速振荡器、 H-2050R高速冷冻离心机(湘仪离心机仪器有限公司).

磷酸盐与硫酸亚铁的标准使用液、 0.5%邻菲啰啉显色剂与1%盐酸羟胺还原剂、 利用钼酸盐储备液1^[22]与钼酸盐储备液2^[20,21]配置的3种磷钼蓝比色法的显色剂(表 1).

表 1(Table 1)

表 1 3种磷钼蓝比色法的显色剂配方 Table 1 Compositions of three coloring reagents for the molybdenum blue method 显色剂 显色剂配方 文献 显色剂 Ⅰ 抗坏血酸固体溶解于钼酸盐储备液 1，比例为 1.5 g∶100 mL [22] 显色剂 Ⅱ 10%抗坏血酸溶液与钼酸盐储备液 2，按体积比 1∶2混合后加入样品 [20, 21] 显色剂 Ⅲ 10%抗坏血酸溶液与钼酸盐储备液 2,按体积比 1∶1先后加入样品 根据显色剂Ⅰ与Ⅱ调整酸度与配比

表 1 3种磷钼蓝比色法的显色剂配方 Table 1 Compositions of three coloring reagents for the molybdenum blue method

显色剂、 显色温度和时间、 显色体积、 显色方式是影响微量比色的主要参数，将其逐一进行优化.①在选择显色剂时，首先在700 nm波长处测定微孔板空白值，测定后的微孔板加不同浓度磷溶液，每个浓度各做6组平行，然后按样品与显色剂体积比10 ∶1分别加入3种显色剂，在其他条件完全一致条件下振荡显色，显色完毕后再次测定其吸光值，样品测定值减去空白值即为样品的真实吸光度，通过分析3种显色剂的方法参数，对比选出最适合的显色剂.②在优化显色温度、 时间和体积时，使用同一浓度的磷溶液分别设置7个体积梯度，7个显色时间梯度和3个显色温度梯度，分别加入已确定的显色剂进行显色，显色过程中保证其他参数条件一致，显色完毕测定吸光值，判断最佳显色时间、 温度与体积.③在确定上述参数后考虑显色方式对磷钼蓝微量比色的影响，将显色后的溶液离心并振荡显色，同时分别做不离心与不振荡的对比实验，通过方法参数的对比，判断离心与振荡对微量比色的影响.

邻菲啰啉微量比色法的操作参照常规方法^[22].显色剂为0.5%邻菲啰啉，还原剂为1%盐酸羟胺，显色完毕后在520 nm波长处测定吸光值.显色温度和时间是影响微量显色的主要参数，设置8个显色时间梯度与4个显色温度梯度，分别作标准曲线，通过吸光值的变化与线性水平确定最佳显色时间和温度.在最佳温度和时间下采取离心与振荡的方式显色，并与不离心和不振荡条件下作对比，通过各方法参数的比较判断显色方式对邻菲啰啉微量比色的影响.

选取太湖北部的梅梁湾作为研究区域布设采样点(选取两个沉积物剖面).现场利用投放器将已充氮去氧的HR-Peeper装置垂直且缓慢插入沉积物中，上覆水保留2~4 cm(装置长18 cm).待装置平衡2 d后取出，迅速用半湿的滤纸将表面的沉积物擦除，将装置装入自封袋中，用与装置暴露窗口面积相同的不锈钢片压住窗口表面，并用夹子固定，通过喷干冰冷冻剂将装置小室内的间隙水样品冷冻，随后装入车载冰箱带回实验室^[19].

将现场冷冻的HR-peeper装置从冰箱拿出，去除自封袋，用塑料膜盖住暴露窗口，并用小玻璃块压住塑料膜，防止样品氧化^[19].待小室内间隙水解冻后，依次取下玻璃块，并用移液枪刺穿塑料膜，分别两次吸取每个小室的溶液6 μL至384微孔板中，用去离子水稀释至30 μL测定DRP，用0.1 mol ·L^-1 HCl稀释至15 μL测定溶解态Fe²⁺.按照已优化的参数方法进行操作，显色后用Epoch微孔板分光光度计测定DRP和Fe²⁺的浓度.

使用线性范围、 检出限、 最低检测限、 精密度和灵敏度分析各参数优化后的结果.线性范围是通过测定时标准液的最低和最高浓度来确定^[23]； 检出限为3倍空白水样的标准偏差^[23,24]； 最低检测限为检出限的两倍^[23]； 精密度用相对标准偏差RSD表示^[23]； 灵敏度用校准曲线的斜率表示^[23].

微量比色的反应室体积小，对显色剂的要求较严格.采用不同显色剂配方在同一条件下显色，结果存在差异.表 2为3种显色剂的方法参数对比，可以看出，显色剂Ⅲ的检出限与最低检出限明显低于另外两者，精密度与灵敏度也略优.显色剂Ⅰ的浓硫酸含量为19.46% (体积分数)，显色剂Ⅱ和Ⅲ的浓硫酸含量为30% (体积分数)，后者酸度较大.显色剂Ⅲ与Ⅱ比较，还原剂的量增加.因此，显色剂Ⅲ主要通过增加显色剂的酸度与还原剂的量来提高测定的精密度，同时降低检出限. 传统磷钼蓝分光光度计法30 min即可显色完全，显色物质在120 min之内保持稳定^{[17, 18, 19, 20]}.从图 1可看出，同一溶液显色，显色剂Ⅰ与Ⅱ的吸光值随着显色时间的增加呈逐渐上升的趋势，这是由于反应在微量体积内进行，显色难以达到完全,线性R2只达到0.99； 显色剂Ⅲ在显色90 min后基本达到稳定，与120 min时的吸光值差异不明显，说明显色基本完全，且线性关系好，R2达到0.999?9，RSD控制在5%之内，精密度高.综合比较，选用优化后的显色剂Ⅲ作为磷钼蓝微量比色的显色剂，显色90 min，其测定结果相对精确.

表 2(Table 2 )

表 2 磷钼蓝比色法使用3种显色剂的方法参数对比 Table 2 Analytical parameters of the three coloring reagents for determining the concentration of DRP 显色剂 线性范围 /mg·L-1 检出限 /mg·L-1 最低检测限 /mg·L-1 相对标准差 (RSD/%) 灵敏度 显色剂 Ⅰ 0~0.6 0.009 0.018 2~6 0.220 显色剂 Ⅱ 0~0.6 0.006 0.012 >5 0.200 显色剂 Ⅲ 0~0.6 0.003 0.006 2~5 0.240

表 2 磷钼蓝比色法使用3种显色剂的方法参数对比 Table 2 Analytical parameters of the three coloring reagents for determining the concentration of DRP

图 1

Fig. 1

图 1 3种磷钼蓝显色剂不同时间下显色的标准曲线 Fig. 1 Calibration curves of the molybdenum blue method using three coloring reagents with different reaction times

微孔板分光光度计的光源从微孔板底部透射，加样量应满铺微孔底部，同时不能溢出微孔.实际操作时发现，溶液样品体积大于6 μL时才能使溶液铺满微孔底部，当样品超过50 μL，操作时易使样品溢出.

表 3为同一磷溶液样品在不同加样量梯度(6 ~50 μL)下显色的吸光值.当样品量为6~15 μL时，测定值小且误差大； 当样品量为20 μL时，测定值仍然较小，但误差明显减小； 当样品量在30~40 μL时，测定值明显升高，且相对标准偏差控制在5%之内.将加样量进一步升高至50 μL时，测定值基本不变，但误差增大.由此可见，加样量可确定为30~40 μL.对于体积少的样品，可通过稀释，将其显色的体积提高至30~40 μL.

表 3(Table 3 )

表 3 磷钼蓝比色法不同样品体积显色的测定误差 Table 3 Analytical error of the molybdenum blue method using different sample volumes for coloration 项目 样品体积/μL 6 10 15 20 30 40 50 平均吸光值 0.062 2 0.056 1 0.063 1 0.059 8 0.091 6 0.105 7 0.103 4 标准差(SD) 0.017 6 0.021 3 0.006 2 0.001 9 0.004 1 0.002 3 0.008 9 相对标准差(RSD)/% 28 38 10 3 4 2 8

表 3 磷钼蓝比色法不同样品体积显色的测定误差 Table 3 Analytical error of the molybdenum blue method using different sample volumes for coloration

图 2为不同温度条件下的标准曲线.可以看出，随着温度的升高，同一浓度溶液在相同显色时间下的吸光值越大.10℃和25℃显色不完全，线性较差(R2只能达到0.99).35℃时显色完全，与45℃的吸光值基本一致，且两者线性好(R2达到0.999).因此，可选定35~45℃作为微量比色的适合温度，显色完全且线性稳定.

图 2

Fig. 2

图 2 磷钼蓝比色法不同显色温度下的标准曲线 Fig. 2 Calibration curves for the molybdenum blue method at different temperatures

离心可使微孔板里的溶液充分混合均匀,消除反应或操作过程中可能产生的气泡.从表 4可看出，离心与不离心的检出限与灵敏度基本一致.这是由于磷钼蓝比色是在强酸性条件下进行，不易产生气泡，同时加样时避免了气泡引入.但进一步研究发现，碱性条件下发生的反应极易产生气泡，必须通过离心消除气泡的影响.

表 4(Table 4 )

表 4 不同显色方式下磷钼蓝比色法的分析参数对比 Table 4 Comparison of the analytical parameters for the molybdenum blue method between different coloring ways 类型 显色方式 线性范围 /mg·L-1 检出限 /mg·L-1 最低检测限 /mg·L-1 相对标准差 (RSD)/% 灵敏度 气泡消除 离心 0~0.6 0.003 0.006 2~6 0.240 不离心 0~0.6 0.003 0.006 2~5 0.230 显色方式 振荡 0~0.6 0.001 0.002 2~4 0.240 静置 0~0.6 0.003 0.006 3~8 0.140

表 4 不同显色方式下磷钼蓝比色法的分析参数对比 Table 4 Comparison of the analytical parameters for the molybdenum blue method between different coloring ways

与磷钼蓝显色反应不同，溶解态铁(Ⅱ)与邻菲啰啉反应进行较快，其显色直接生成橙红色络合物，没有中间产物过渡.相应地，对溶解态铁(Ⅱ)微量比色的参数优化较为简单，与常规方法基本一致.

图 3为Fe²⁺与邻菲啰啉在不同显色时间和温度条件下反应的标准曲线.图 3(a)为35℃下振荡显色不同时间的吸光值，显色15 min后吸光值基本稳定，继续延长显色，其吸光值保持不变，故选择15 min作为亚铁微量显色的最佳时间.从图 3(b)可以看出，随着温度的上升，吸光值逐渐升高，25℃的吸光值略低于35℃，35℃与45℃的吸光值基本重合.因此，微量比色的合适温度可确定为35℃.

图 3

Fig. 3

图 3 不同时间和温度条件下邻菲啰啉比色法的标准曲线 Fig. 3 Calibration curves for the phenanthroline colorimetric method at different times and temperatures for coloration

邻菲啰啉分光光度法测定亚铁是以冰乙酸作为缓冲液，酸性条件下显色不易产生气泡，所以微量比色时不需要离心，但显色时需要振荡，使得溶液充分混匀，促使显色反应在较短的时间内达到完全.

目前已经发展了96微孔板对DRP和Fe²⁺的微量比色分析方法^[26,27]，一次性分析样品的数量为96个，需要的样品体积100~200 μL(稀释后).本研究发展的384微孔板微量比色方法与前者相比，一次性分析样品的数量为384个，所需的样品体积为30~40 μL(稀释后)，在提高分析效率和节省试剂方面具有明显的优势.将两种方法与传统的分光光度计方法^[25]进行了对比，各方法的参数列于表 5.可以看出，384孔微量比色测定DRP的检出限、 最低检测限及精密度略逊于96孔，但优于传统的分光光度计方法.测定Fe²⁺的检出限、 最低检测限及精密度均与96孔相当，在检出限与最低检测限方面优于分光光度计方法.总之，384微孔板微量比色方法的参数经过优化后，满足了微量样品大批量分析的要求.

表 5(Table 5 )

表 5 两种微量比色法与传统分光光度法测定 DRP与 Fe2+的参数对比 Table 5 Comparison between two microplates and traditional spectrophotometer for determining DRP and Fe2+ 测定元素 测定方法 线性范围 /mg·L-1 检出限 /mg·L-1 最低检出限 /mg·L-1 相对标准差 (RSD%) 灵敏度 384微孔板 0~0.6 0.003 0.006 2~5 0.240 DRP 96微孔板 0~0.6 0.002 0.004 1~4 0.300 分光光度计 0~0.6 0.004 0.008 1~5 0.450 384微孔板 0~5.0 0.003 0.006 2~5 0.043 铁 (Ⅱ) 96微孔板 0~5.0 0.003 0.006 1~5 0.057 分光光度计 0~5.0 0.010 0.020 1~5 0.045

表 5 两种微量比色法与传统分光光度法测定 DRP与 Fe2+的参数对比 Table 5 Comparison between two microplates and traditional spectrophotometer for determining DRP and Fe2+

通过HR-Peeper装置在2 mm尺度上获取了太湖梅梁湾沉积物两个剖面的微量间隙水样品，利用上述优化的微量比色方法，对间隙水样品的DRP和Fe²⁺进行了分析.从图 4可以看出，上覆水中DRP和Fe²⁺的浓度均在0.1 mg ·L^-1以下，且数值较为稳定； 由沉积物-水界面向下，DRP和Fe²⁺浓度均随深度的增加而升高，在界面下20 mm附近达到局部最大值； 随后Fe²⁺浓度呈现降低的趋势，DRP则在剖面底部出现升高或降低的趋势.在界面至-20 mm处，DRP和Fe²⁺浓度的同步变化反映了两者的耦合关系，即磷在沉积物中的二次迁移和活性受到铁氧化-还原反应的控制，铁氧化物在缺氧和厌氧条件下发生溶解，促使溶解态Fe²⁺与铁结合态磷出现同步释放和浓度升高的现象，并在界面附近形成浓度梯度，通过磷向上覆水体的扩散造成内源性污染^[5].

图 4

Fig. 4

图 4 沉积物间隙水中 DRP和 Fe2+的垂向分布 Fig. 4 Concentrations of DRP and Fe2+ in pore waters with the depth of two sediment profiles

与已有方法相比，将HR-Peeper装置与本研究发展的微量样品大批量分析方法结合后，可以将界面溶解态磷和铁的垂向分辨率从cm级提高到mm级，获取时间从20 d左右缩短到2 d，基本实现了溶解态磷和铁在界面附近浓度梯度分布信息的准确、 实时获取，为估算内源磷负荷、 揭示内源磷污染规律与形成机制提供关键信息.

(1)DRP微量比色方法：加入适量溶液样品于微孔中，并用去离子水稀释至30 μL，按溶液与显色剂体积比10 ∶1加入显色剂Ⅲ，将微孔板置于微振荡器上，35℃振荡显色90 min后，用Epoch微孔板分光光度计于700 nm波长处测定其吸光度，减去空白值后，根据标准曲线换算成样品浓度.

(3)384微孔板微量比色法具有大批量分析微量体积样品的优势，尤其适用于微量间隙水样品的高分辨分析.此外，本研究发展的方法可以拓展到其他元素(如氨氮)、 酶活等指标的测定，为满足微量环境样品的分析要求提供重要的技术支撑.

致谢 ：本实验在采样过程中得到河海大学陈义飞的帮助，分析过程中得到中国科学院南京地理与湖泊研究所姚磊的协助，在此表示诚挚感谢.