2014, Vol. 
2. 江西理工大学建筑与测绘工程学院, 赣州 341000
2. School of Architectural and Surveying & Mapping Engineering, Jiangxi University of Science and Technology, Ganzhou 341000, China
随着经济的快速发展，越来越多的含氮、磷废水以及生活污水排入水体，使湖泊和水库等富营养化现象日益加剧，由此引发的蓝藻水华现象日趋严重. 当蓝藻水华严重时，水面形成厚厚的蓝绿色湖靛，散发出难闻的气味，不仅破坏了健康平衡的水生生态系统，而且还因藻细胞产生并释放多种藻毒素而对人和动物的饮用水安全构成了严重的威胁. 目前，水华蓝藻可以产生多种藻毒素，其中微囊藻毒素(microcystins，MCs) 是一类在蓝藻水华污染中检出率最高、 危害最严重和产生量最大的藻毒素种类. 面对天然淡水水体富营养化程度日益加剧和蓝藻水华暴发越来越频繁的局势，如何控制蓝藻的过量繁殖生长和有效去除MCs已成为我国乃至世界环境科学领域的一个难题. 本文针对在淡水中的主要藻毒素类型MCs 的结构与毒性、 降解菌株、 酶催化降解、 降解基因、 生物降解途径与分子机制方面的研究进展进行综述，以期为解决我国日益严峻的湖库水体MCs污染和饮用水安全问题提供参考.
MCs是一类单环七肽化合物(图 1)，相对分子量在1 000左右，其一般结构是：D-丙氨酸在1位置，2个不同L-氨基酸在2和4位置，D-谷氨酸在6位置. 另外3个特殊的氨基酸分别为：3位置的D-赤-β-甲基天冬氨酸(Masp)，5位置的(2S，3S，8S，9S)-3-氨基-β-甲氧基-2，6，8-三甲基-10-苯十基-4，6-二烯酸(Adda)，7位置的N-脱氢丙氨酸(Mdha). 由于Adda基团和Masp基团的甲基化和去甲基化差异，以及在2和4位置的两个可变L-氨基酸的不同，造成了多种类型的MCs. 2和4位置的两个可变L-氨基酸X和Z的代表字母被用来区分不同的MCs种类. 目前，已经从不同的微囊藻中分离鉴定了80多种MCs[1,2]. 但产生量最大、 分布最广泛和造成危害最严重的是MC-LR和MC-RR(L、 R分别代表亮氨酸和精氨酸).
 | 图 1 MCs的化学分子结构通式 Fig.1 Chemical structure of MCs X和Z分别代表可变氨基酸 |
MCs由于携带Adda特殊结构而具有很强的毒性[3]，其不仅使植物的幼苗发生变形、 重量减少、 叶片的光合作用效率降低[4,5]，而且能干扰鱼类胚胎的发育，引起胚胎孵化率降低，还对胚胎有致畸作用. 动物若直接接触或饮用含有MCs的水会造成昏迷、 肌肉痉挛、 呼吸急促和腹泻等中毒症状. 人若直接接触含MCs的水华蓝藻，会造成皮肤、 眼睛过敏、 发烧、 疲劳以及急性肠胃炎. 如果经常接触或饮用含MCs水体，则会引发皮肤癌、 肝炎和肝癌等病症[6]. 长期饮用含有MCs水的人群中，肝癌的发病率明显高于饮用深井水的人群[7]. 因此，世界卫生组织推荐饮用水中MC-LR的浓度不高于1.0 μg ·L-1[8].
由于MCs具有环状结构和间隔双键，在水体中相当稳定，混凝、 沉淀和过滤及其组合单元工艺对蓝藻细胞分离效果好，而对溶解性MCs的去除效果差； 高锰酸钾、 臭氧和氯等化学药剂氧化法对降解溶解性MCs效果明显，但容易带来“三致”物质以及消毒附产物等，造成二次污染； 光催化降解以及活性炭吸附在减少水中MCs效果较好，光催化降解工艺操作复杂，活性碳吸附难于二次回收利用等缺点制约其在这方面的进一步应用. 而生物处理MCs具有高效、 运行成本低、 无二次污染等优点，目前主要采用混合菌和纯菌种对MCs进行生物降解.
具备降解MCs能力的土著菌在天然水体及其沉积物中均有所发现. 吴振斌等[9] 研究了人工湿地系统对MCs的去除效果及影响因素，发现以含蓝藻水华的鱼塘水为原水，当进水含MCs (0.117 μg ·L-1) 时，去除率50%左右，其中对MC-YR的去除效果最好. 吕锡武等[10] 考察了MC-LR、 MC-RR和MC-YR经序批式膜生物反应器的处理效果，经24 h处理后发现3种MCs的去除率均高于90%. 金丽娜等[11]发现沉积物的用量以及反应体系温度对滇池沉积物生物降解MCs影响较大，经过初步筛选分离得到了能够在3 d内完全降解MC-RR (50 mg ·L-1)和MC-LR (30 mg ·L-1) 的混合菌群微生物[12]. 在暴发蓝藻水华污染的水体以及水体沉积物中发现存在具备降解MCs能力的微生物[13, 14, 15]. Inamori等[16] 利用需氧菌对水体中的MCs进行降解研究，结果发现该菌能够在10 d内将MCs (40 mg ·L-1) 完全降解. 污水厂排污口也存在能够快速降解MCs的微生物，其在2 d之内将MC-LR (182~837 μg ·L-1) 完全降解[17].
由此可见，对MCs有降解能力的微生物菌种普遍存在于天然水体中，筛选分离出具有高效降解MCs的纯菌种，可以为进一步研究及其应用奠定良好基础.
目前，国外有关分离降解MCs纯菌种的报道较多. Jones等[18]最早从天然水体中分离出1株对MC-LR有一定降解能力的纯菌种ACM-3962，并将其分类为鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas). 随后，日本学者在此方面开展了大量研究. Takenaka等[19] 从天然水体中分离出1株对MC-LR有降解能力的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，它能在20 d内将MC-LR (初始浓度50 mg ·L-1) 去除90%以上. Park等[20] 和 Ishii等[21] 分别从日本Suwa湖中分离出了1株对MCs具备较高降解能力的纯菌种Y2和7CY，其中Y2菌对MC-RR和 MC-LR 的最大日降解速率分别达到13.0 mg ·L-1和5.4 mg ·L-1. 通过16S rDNA分析发现，二者均属鞘氨醇单胞菌，并且7CY 与Y2之间有较高的同源性. Tsuji 等[22] 从日本的Tsukui湖中分离出1株对MCs有降解能力的微生物纯菌种B-9，1 d内可将一定浓度的MCs全部降解，最后通过16S rDNA分析发现，B-9与鞘氨醇单胞菌Y2的同源性高达99%. Saito等[23] 从中国贵阳市某发生水华的湖泊和日本Kasumigaura湖中分别分离了1株具有降解MCs能力的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas) C-1和MD-1. 2005年，德国学者Valeria等[24]从阿根廷的水库中筛选出1株鞘氨醇单胞菌CBA4，该菌36 h内就能将浓度为200 μg ·L-1的MC-RR完全降解. 2007年，Ho等[25]从生物沙滤器分离出1株能够降解MC-LR和MC-LA的菌种LH21，经16S rDNA鉴定为Sphingopyxis sp.，后经PCR扩增发现该菌株具有降解MCs完整的mlr基因簇.
进入21世纪后，国内在MCs降解菌种筛选方面开始进行研究. 2002年，笔者从滇池底泥中分离出1株纯菌种青枯菌(Ralstonia solanacearum)，该菌3 d内可将初始50.2 mg ·L-1的MC-RR和30.1 mg ·L-1的MC-LR 全部降解，日均降解速率分别达16.7 mg ·L-1和9.4 mg ·L-1[26]. 周洁等[27] 从滇池底泥中筛选出1株对MCs有着更强的降解能力的食酸戴尔福特菌(Delftia acidovorans)，在2 d内可将初始90.2 mg ·L-1的MC-RR和39.6 mg ·L-1的MC-LR全部降解，日均降解速率分别提高到45.1 mg ·L-1和19.8 mg ·L-1. Wang等[28]从滇池底泥中分离出1株鞘氨醇单胞菌(Sphingopyxis sp.USTB-05)，其在36 h内将初始42.3 mg ·L-1的MC-RR全部降解，而该菌的无细胞提取液(350 mg ·L-1蛋白)则在10 h内将初始42.3 mg ·L-1的MC-RR全部降解. 宦海琳等[29] 从南京发生水华的水体中筛选分离出了5株降解MCs能力较强的细菌，经过鉴定发现分别属于芽孢杆菌属(Bacillus)、 肠杆菌属(Enterobacter)、 不动杆菌属(Acinetobacter)、 弗拉特氏菌属(Frateuria)和微杆菌(Micro bacterium). 刘海燕等[30] 从南京发生水华的水体中分离出对MC-LR有显著降解能力的菌株S3，经16S rDNA序列比对分析显示，该菌与类芽孢杆菌(Paenibacillus validus)的相似性达98%. 苑宝玲等[31]研究了假单胞菌(Pseudomonas)M-5、 M-6及气单胞菌(Aeromonas)M-7混合培养与单菌株培养对MC-LR的降解效率，结果表明，混合菌株对MCs的降解效果明显优于单菌株，说明混合菌株之间具有协同生长效应. 但同时认为菌株之间的组合具有很大的随机性，还需从菌株的生理生化特性及对污染物的降解过程和机理的研究入手，探讨具有协同作用菌株的组合过程.
此外，在Stenotrophomon [32]、 Sphingosin-icella[33] 、 Poterioochromonas [34]、 Burkholderia[35]、 Brevibacterium[36] 、 Rhodococcus[36] 和Kurthia gibsonii[37] 等菌属中也发现了可降解MCs的菌种. 目前，国内外报道能降解MCs的菌种多达50多种(部分可降解MCs的菌种见表1所示)，涵盖的菌属较广，但主要为鞘氨醇单胞菌属的菌种.
酶催化降解MCs发挥至关重要的作用. 文献[41, 42]研究了假单胞菌(Pseudomonadaceae)M-6细胞内外提取液对MC-LR的降解效率，结果表明，细胞外提取液对藻毒素没有降解作用，胞内酶粗提液能在24 h内降解MC-LR，日均MC-LR降解率是纯菌株M-6的4.7倍，从而得出假单胞菌M-6降解MCs的酶属于胞内酶，并且认为MC-LR快速降解主要归于细胞内酶的催化作用. 通过降解产物的分析，得出至少有3种酶参与了MC-LR的降解. 王俊峰[43]也认为鞘氨醇单胞菌USTB-05降解酶属于胞内酶，并发现酶催化降解远远高于菌细胞降解MC-RR的速率.
从分子水平上研究微生物降解MCs基因的功能，可以为弄清MCs降解途径及其分子机制奠定基础. Bourne等[44] 对鞘氨醇单胞菌ACM-3962降解MC-LR的基因簇进行了详细的研究. 通过HPLC检测MC-LR降解产物出现的个数，判断ACM-3962至少有3种酶(MlrA、 MlrB、 MlrC)依次参与了MC-LR的催化降解，对应mlrA、 mlrB、 mlrC和mlrD 这4段降解基因(图 2)，其中mlrD为转运基因. 通过降解基因的克隆与异源表达，发现该4段基因包含在1段相邻长度为5.8 kb的DNA片段中，其中mlrA所编码的第一个MCs酶(MlrA) 属于一种金属蛋白酶，由336个残基组成的肽链内切酶； 位于mlrA下游且具有相同翻译方向的是基因mlrD，是一个寡肽转运子； mlrB则位于它们的下游并具有相反翻译方向； 基因mlrC位于mlrA上游具有相反的翻译方向，也是一种金属蛋白酶.
 | 表1 部分可降解MCs的菌种及详细信息 Table 1 Part of MCs-degrading strains and its information |
 | 图 2 ACM-3962菌mlr基因簇信息 [44] Fig.2 Information about the mlr gene cluster of ACM-3962 strain 虚线箭头为基因编码方向 |
Saito等[45]通过 PCR技术对具有降解能力的鞘氨醇单胞菌 Y2 菌和鞘氨醇单胞菌MD-1 菌进行检测，在它们的DNA中均发现mlrA基因的存在，并且与 菌ACM-3962具有很高的同源性； 另一方面，在1株与鞘氨醇单胞菌属非常相近的菌种中却未检测到mlrA基因的存在. 因此，Saito等[45]推测mlrA 基因存在于3种不同的菌属中，该独特的MCs降解基因并不一定存在于鞘氨醇单胞菌属中. Jiang等[39]对Novosphingobium sp. THN1的mlr簇基因异源表达进行了研究，发现mlrA具有降解MC-LR的活性. Shimizu等[46]发现Adda对mlrA和mlrB的诱导表达发挥重要作用，MC-LR的环状结构与mlrC的诱导有着紧密的联系. 王俊峰[43] 在分子水平上对Sphingopyxis sp. USTB-05菌降解MC-RR的活性进行了研究，发现该菌中含有4段类似于mlr的基因(表 2)，该基因簇与ACM-3962菌中mlr簇基因具有很高的同源性.
尽管国内外对MCs降解基因进行了研究，但总体来说仍处于起步阶段. 目前的研究大部分集中在鞘氨醇单胞菌mlr簇4段降解基因上，但根据Hashimoto等[47]的研究结果可以推测，参与降解MCs的基因远不止这4段基因，至于这些降解基因的功能特性研究基本上还没涉及. 而其它菌属降解MCs的研究却仍停留在菌种或粗提酶的降解特性上，还没有进入分子水平上的研究.
| 表 2 USTB-05菌降解MCs基因序列信息 [43] Table 2 Information about the mlr gene cluster of USTB-05 strain |
 | 图 3 ACM-3962菌酶催化降解MC-LR途径 [44,49] Fig.3 Proposed degradation pathway of microcystin LR by ACM-3962 strain 细箭头为肽键断开的位置 |
对于MCs的途径，多肽类化合物的生物降解途径一般遵循由多肽到二肽，再到氨基酸和氨的转化过程[26,48]. 因为MCs属于环状七肽化合物，因此推测其生物降解中至关重要的一步是环状MCs转化为线型MCs的过程. Cousins等[13]研究了微生物降解MC-LR的作用机制，推测MC-LR降解途径可能有两种，一种是通过裂开其中的一个肽键来开环，形成的七肽直链又通过打开肽键形成更小的多肽； 另外一种是Adda基团侧链在生物酶的作用下共轭双键被破坏，或者是精氨酸侧链被降解. Bourne等[44,49]研究认为MlrA首先负责打开位于Adda与精氨酸之间的肽键，使环状的MC-LR变成线型的MC-LR； MlrB负责将线型MC-LR肽链上连接丙氨酸与亮氨酸的肽键进一步断裂，生成四肽化合物； 而MlrC则负责将四肽化合物更进一步降解，产物是更小的氨基酸和多肽(图 3). Yan等[50] 对鞘氨醇单胞菌USTB-05降解MC-LR的途径进行了研究，认为USTB-05菌降解MC-LR的第一步是打开MC-LR环上连接(Adda与精氨酸的肽键，同时加上一个氢和羟基，将环状MC-LR转化为线型MC-LR). 王俊峰[43] 认为MCs中Adda与精氨酸之间的肽键首先被打开的原因是因为该肽键键能比其它的要小，容易受到攻击而断裂. Shimizu等[51] 对Sphingopyxis sp. C-1菌的mlrB及mlrC进行了克隆与表达，发现MlrB能把线性的MC-LR降解成四肽，而MlrC既能把线性的MC-LR降解成Adda，也能把生成的四肽降解成Adda (图 4). Hashimoto等[47]却用“Marfey”方法在B-9菌降解MC-LR的过程中检测出除线性MC-LR、 四肽(Adda-Glu-Mdha-Ala)及Adda以外的其它7种降解产物，并推测出了mlr簇基因降解MC-LR与文献[44, 46]不同的可能途径(图 5).
 | 图 4 mlr基因簇降解MC-LR的可能途径
[51]
Fig.4 Microcystin degradation pathway mediated by the mlr gene cluster
|
闫海[26] 在筛选出高效降解MC-RR菌——青枯菌(Ralstonia solanace arum，RS)的基础上，对MC-RR的生物降解分子途径进行了推测，发现至少有2种酶参与了MC-RR的降解过程，环状MC-RR的Adda与精氨酸之间的肽键在第1种酶的作用下被断裂，变成线型MC-RR，接着线型MC-RR在第2种酶的催化下进一步脱水缩合，形成具有2个小肽链环的线型MC-RR作为酶催化降解的最终产物(图 6). 周洁等[27] 对食酸戴尔福特菌(Delftia acisdovorans，DA菌)降解MC-RR的途径进行了初步研究，发现有3种酶参与了MC-RR的酶促反应，分别生成了3个代谢产物，其中2个中间代谢产物和1个最终产物. 何宏胜等[52] 发现铜、 锰、 锌等金属离子对DA菌酶促反应均没有促进作用.
 | 图 5 B-9菌酶催化降解MC-LR途径
[47]
Fig.5 Proposed degradation pathway of microcystin LR by B-9 strain
|
综上所述，目前国内外提出了4种MCs微生物的降解途径，但仍然还不够全面. 要探明每种微生物降解MCs的途径，首先要弄清楚MCs在降解过程中究竟产生了多少种产物，但是由于检测方法的局限，目前还不能检测出所有MCs酶催化降解的中间和最终产物，故不能推测究竟有多少酶参与了MCs的降解过程，也就无从弄清微生物降解MCs的确切途径.由于降解途径还只是推测，故MCs微生物降解的分子机制也就很难进行深入研究，因此在MCs的降解途径及分子机制方面仍然需做大量的研究工作.
 | 图 6 RS菌酶催化降解MC-RR途径 [26] Fig.6 Proposed degradation pathway of microcystin RR by Ralstonia solanace arum 细箭头为肽键断开的位置 |
随着全球气候变化引起的温度升高和大量含氮磷废水排入天然水体，蓝藻水华污染的形势依然非常严峻. 虽然采用物理和化学等方法能够去除MCs，但目前发现生物降解法是最有效的MCs去除方法. 虽然国内外在MCs的生物降解领域已经取得了很大的进展，但在如下方面还有待于进一步加强.
(1)MCs的生物降解途径与分子机制 不同的微生物菌种可能采用不同的途径对MCs进行生物降解，因此随着高效降解MCs新菌种的不断发现，对于丰富和发展MCs生物降解途径与理论具有重要的意义.
(2)MCs降解基因的克隆与表达 研究发现酶催化比微生物细胞降解MCs具有更高的速率，因此通过构建高效基因工程菌，提高降解MCs酶的表达量并应用，在基础和应用研究方面都具有重要的意义与价值.
(3)高效降解MCs菌的高密度发酵培养与应用 采用现代发酵工程技术，通过超高细胞浓度降解MCs菌的发酵培养控制，生产出对应的微生物制剂和酶制剂，通过投加可以高效去除水体中的MCs. 目前，国内外尚未发现此领域的研究报道，是一项环境微生物技术的重要发展方向.
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