环境科学  2014, Vol. Issue (3): 1169-1175   PDF    
引用本文
张英伟, 柴立伟, 王东伟, 汪杰, 黄艺. Cu和Cd胁迫下接种外生菌根真菌对油松根际耐热蛋白固持重金属能力的影响[J]. 环境科学, 2014, (3): 1169-1175.
ZHANG Ying-wei, CHAI Li-wei, WANG Dong-wei, WANG Jie, HUANG Yi. Effect of Ectomycorrhizae on Heavy Metals Sequestration by Thermostable Protein in Rhizosphere of Pinus tabulaeformis Under Cu and Cd Stress[J]. Environmental Science, 2014, (3): 1169-1175.
Cu和Cd胁迫下接种外生菌根真菌对油松根际耐热蛋白固持重金属能力的影响
张英伟, 柴立伟, 王东伟, 汪杰, 黄艺     
北京大学环境科学与工程学院, 北京 100871
收稿日期: 2013-7-23; 修订日期: 2013-9-25.
基金项目： 国家自然科学基金项目（41271325）
作者简介：张英伟(1987~),女,硕士研究生,主要研究方向为水环境控制与环境生物技术,E-mail:zhangyingwei2011@126.com
通讯联系人,E-mail:yhuang@pku.edu.cn
摘要：铜和镉是我国土壤重金属常见种类，生物固定过量重金属以降低其生理毒害是修复土壤重金属污染的有效方法之一. 外生菌根能够通过分泌大量有机物质来降低土壤中重金属的生物有效性. 在Cu或Cd胁迫下，外生菌根真菌接种油松幼苗根际分泌的耐热蛋白具有固持重金属的潜力. 结果表明，纯培养条件下接种并没有增加耐热蛋白的分泌，但是在Cu或Cd的胁迫培养下，接种幼苗耐热蛋白的分泌量增加. 不同Cu浓度处理下，接种油松幼苗总提取耐热蛋白（total thermostable protein，TTP）和易提取耐热蛋白（easily extracted thermostable protein，EETP）的分泌量为未接种油松的2.64~11.79倍；Cd处理下接种油松TTP和EETP的分泌量，分别是未接种油松的1.49~7.56倍. 虽然Cu处理下无论是接种还是未接种，根际耐热蛋白和根系细胞中固持的总Cu量显著大于空白对照，但接种显著增加了根际的重金属固持量，其Cu总相对含量是未接种的1.81~2.75倍，且绝大部分重金属固持在耐热蛋白中，使得根际耐热蛋白中的Cu相对含量是根系细胞含量的4.19~43.00倍. Cd处理下也得到了相似的结论. 说明接种菌根真菌促进了植物分泌耐热蛋白量，加强了根系对重金属的固持能力，从而达到减少过量重金属的生物有效性，缓解土壤重金属污染的目的.
关键词： Cu     Cd     菌根     耐热蛋白     固持重金属    
Effect of Ectomycorrhizae on Heavy Metals Sequestration by Thermostable Protein in Rhizosphere of Pinus tabulaeformis Under Cu and Cd Stress
ZHANG Ying-wei, CHAI Li-wei, WANG Dong-wei, WANG Jie, HUANG Yi     
College of Environmental Sciences and Engineering, Peking University, Beijing 100871, China
Abstract: Copper and cadmium in soil is a severe soil pollution problem in China. It is effective to remediate the soil by sequestrating Cu and Cd with tolerant plant and microorganism. Ectomycorrhizae could exude a large number of organic matter to reduce the biological effectiveness of heavy metals. Therefore, under Cu or Cd stress, thermostable protein in rhizosphere exuded by roots of pine seedling (Pinus tabulaeformis) associated with ectomycorrhizal fungi (Xerocomus chrysenteron) can have the potential of sequestration for heavy metals. The results illustrated that the association didn't impact on exudation of thermostable protein but treated with different concentrations of Cu,the total thermostable protein (TTP) and easily extracted thermostable protein (EETP) in mycorrhizal rhizosphere increased by 2.64 to 11.79 times compared with non-mycorrhizal one. While treated with Cd, it was 1.49 to 7.56 times. Further analysis of metal content in rhizosphere showed that association significantly increased the Cu sequestration in mycorrhizal rhizosphere where relative content of Cu was 1.81 to 2.75 times higher than those in non-mycorrhizal rhizosphere while most of Cu was sequestrated by thermostable protein, 4.19 to 43.00 times higher in protein than in root cell. Meanwhile results of Cd treatments showed a similar trend with Cu treatments. That indicated that under excessive heavy metals stress, ectomycorrhizal association facilitated the exudation of thermostable protein so as to extend the capacity of sequestration for excessive heavy metals and mitigate the phytotoxicity from heavy metals polluted soil.
Key words: Cu     Cd     mycorrhiza     thermostable protein     heavy metals sequestration    

土壤是人类赖以生存的资源，而中国约2 000万hm2的农业土地受到重金属的污染，并可能通过食物链对人体健康造成严重的危害[1]. 因此，缓解土壤重金属污染，成为保护国家生态安全的重要任务之一.

大量研究表明，菌根真菌能够分泌有机酸、糖类、蛋白质等有机物，改变植物的根际环境和重金属的存在状态，增加其寄主植物在重金属胁迫下的适应能力[2～4]. Heggo等[5]认为，菌根是通过改变土壤pH 值和分泌物成分，减弱重金属的生物有效性. 黄艺等[6]在研究离体培养的外生菌根真菌牛乳牛肝菌(Suillus bovinus)菌丝对过量重金属响应的实验中发现，菌丝分泌物中含有大量重金属，推测菌丝分泌物可能是菌根真菌固持重金属的重要部位. 另外，陈家武等[7]在比较接种和不接种菌根真菌的玉米根际土壤的研究中发现，根外菌丝体可以分泌菌丝黏液，影响根际土壤微量金属的形态，使金属从游离态转化为结合态，从而缓解重金属对玉米生长的胁迫. 随着对菌根分泌物的研究，耐热蛋白球囊霉素相关土壤蛋白(glomalin-related soil protein,GRSP)作为丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)分泌的一种具有改善土壤结构以及固持重金属作用的糖蛋白，逐步进入了研究者的视野[8～11]. 大量研究表明，球囊霉素相关土壤蛋白能够固持污染土壤中多种重金属，能够固持土壤中1.44%～27.5%的总铜量和 0.8%~15.5%的总铅量[10, 12, 13]. 然而，对于外生菌根真菌分泌的耐热蛋白的研究，却鲜有报道.

因此，本研究提出假设：作为主要菌根真菌种类之一的外生菌根真菌，接种于植物根系后，在重金属胁迫下可能分泌与球囊霉素相关土壤蛋白相似的耐热蛋白，以缓解过量重金属的植物毒害. 本研究拟通过热提取的方法获得油松根际分泌物中的耐热蛋白，分析不同铜镉处理下接种对根际分泌耐热蛋白量和固持重金属能力的影响，探讨菌根真菌通过耐热蛋白固持重金属降低其生理毒害，从而缓解土壤重金属污染的机制.

1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌种与植物来源

本实验采用无污染的北京西山针叶林的外生菌根真菌红绒盖牛肝菌(Xerocomus chrysenteron)，由北京林业大学森林病理研究室雷增普教授采集、鉴定和提供. 所用植物为油松(Pinus tabulaeformis)，由北京林业局种子库提供.

1.1.2 真菌培养

菌根真菌Xerocomus chrysenteron母菌接种于固体培养基上，生物膜封口，置于25℃恒温培养箱培养一周. 在无菌条件下用打孔器在菌体边缘取直径8 mm的圆菌块，作为菌丝培养的接种体，置于50 mL的灭菌Kottke营养液中，在25℃以120 r ·min-1匀速振动下，培养1周，获得实验用菌丝.

1.1.3 幼苗培养与接种

自来水洗净并挑选出颗粒饱满、无病虫害的油松种子，经10%的过氧化氢溶液浸泡30 min表面消毒后，用灭菌去离子水冲洗5~6次，浸于50~60℃的去离子水中，置于40℃的恒温培养箱中24 h以催芽，而后将种子转移至盛有珍珠岩的培养皿上发芽. 待种子露白后，将其根部朝下种于盛有珍珠岩的塑料盒中(盒长25 cm，宽17.5 cm，高10 cm，栽种密度为每盒16棵)，放入人工气候培养室(25℃光照，14 h；18℃黑暗，10 h)培养，每周每盒交替浇一次200 mL的蒸馏水或不含葡萄糖、稀释到10%的Kottke营养液. 幼苗生长4周后，掘出幼苗在无菌环境下进行接种. 将菌丝在搅拌器中打散并搅拌均匀制成悬浮液作为接种体，幼苗根部用无菌水洗净后，浸入菌丝悬浮液中使其沾满菌丝体，然后种植于装有灭菌珍珠岩的保鲜盒中. 以幼苗根部浸入灭活后冷却的菌丝悬浮液为未接种对照. 所有幼苗置于人工气候培养室中培养(25℃光照，14 h；18℃黑暗，10 h)6周. 培养期间，每周每盒交替浇一次200 mL蒸馏水或不含葡萄糖、稀释到10%的Kottke营养液.

1.2 实验设计

使用非土壤型固体培养体(石英砂)，构建人工根际环境(图 1).

图 1 植物培养体系 Fig.1 Plant culture systems

研究铜胁迫下Xerocomus chrysenteron接种对油松根际蛋白质分泌量及对重金属的固持作用的影响，使用CuSO4 ·5H2 O母液配制出0、2、50、150 mg ·kg-1共4个不同铜含量的石英砂培养体系，每个处理4个平行.

研究镉胁迫下Xerocomus chrysenteron接种对油松根际蛋白质分泌量及对重金属的固持作用的影响，使用CdCl2 ·2.5H2 O母液配制出0、 0.5、 0.75、1.5 mg ·kg-1这4个不同镉含量的石英砂培养体系，每个处理4个平行.

将镜检有二杈小根的幼苗和根系镜检无菌丝的对照幼苗转移到石英砂中培养. 所有幼苗培养4周后取样.

采用直径为20 mm的采样管提取根系周围的石英砂和苗木. 风干后的石英砂称取干重，然后用缓冲液提取石英砂中的根系分泌物，以供后续实验使用；风干后的幼苗取其根系称重，以备后续重金属含量测定.

1.3 蛋白质提取

根据Rillig[14]在研究球囊霉素时，依不同热提取条件对球囊霉素相关土壤耐热蛋白的分类方法，在该研究中将菌根分泌的耐热蛋白分为易提取耐热蛋白(easily extracted thermostable protein,EETP)和总提取耐热蛋白(total thermostable protein,TTP).

提取EETP时，在50 mL血清瓶中加入10 mL柠檬酸钠缓冲溶液(20 mmol ·L-1,pH 7.0)，并按比例加入风干后的样品，121℃高温高压提取30 min，5 000 r ·min-1离心10 min分离后，保存提取液备用. 提取TTP是在50 mL血清瓶中加入10 mL柠檬酸钠缓冲溶液(50 mmol ·L-1,pH 8.0)，121℃高温高压提取60 min，5 000 r ·min-1离心取出提取液，再加入等量缓冲溶液循环多次直到提取液中不能检出蛋白质，收集提取液作为总提取蛋白质；或者一次性提取90 min，收集提取液[8,15].

1.4 测定方法
1.4.1 蛋白质含量测定

使用考马斯亮蓝法测定样品中的蛋白质含量[16].

1.4.2 重金属含量测定：

在聚四氟乙烯瓶中，加入3 mL TTP或10 mg油松根系，1 mL HNO3在电热板上消解30 min(防止烧干)，加入少许H2 O2至液体透明，定容至25 mL，4℃保存于15 mL塑料离心管中，待测. 使用美国Thermo Fisher Scientific公司生产的XSeries 2电感耦合等离子质谱(inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS)测定消解样品中铜和镉的含量，每个样品平行测定3次.

1.5 数据处理

应用Excel 2007和SPSS 16.0对数据进行统计分析.

2 结果与分析
2.1 接种对根系分泌耐热蛋白的影响

通过8周的纯培养及连续取样发现，幼苗生长时间影响根系耐热蛋白的分泌量(P＜0.05). 在8周的培养周期内，随着培养时间的增加，无论接种还是未接种，油松根际耐热蛋白的分泌量呈现先增加后减少的变化趋势，且在第4周根际耐热蛋白的量达到最大值(图 2).

图 2 油松分泌耐热蛋白量随时间的变化 Fig.2 Thermostable protein content changes with time exuded by Pinus tabulaeformis

但是接种并没有显著改变根系的耐热蛋白分泌量(P＞0.05). 幼苗生长4周后，接种条件下TTP和EETP比未接种的虽然高8.9%和7.0%，但差异并不显著. 另外，接种条件下EETP约占TTP总量的92%，未接种条件下EETP约占TTP总量的93%，可见无论在接种还是未接种条件下，易提取耐热蛋白都是该类耐热蛋白的主要组成部分.

2.2 铜镉胁迫下接种油松分泌耐热蛋白含量变化

与无重金属胁迫时，接种和不接种根系耐热蛋白分泌量没有显著变化的结果不同，在过量Cu和Cd胁迫下，接种显著增加了油松根际耐热蛋白的分泌量(P <0.05，图 3). 其中，Cu 50 mg ·kg-1和Cd 0.75 mg ·kg-1处理下，接种油松根际分泌耐热蛋白最多，TTP分别是未接种幼苗的6.81倍和7.56倍，EETP为11.79倍和7.49倍. 与无重金属处理的空白对照相比，接种幼苗根系分泌TTP量在Cu处理下为对照的3.21～6.39倍，Cd处理下为1.25～3.62倍. 说明过量Cu和Cd胁迫，诱导了外生菌根真菌接种根际耐热蛋白的分泌.

为了进一步分析菌根真菌对处于重金属胁迫下的寄主植物抗胁迫能力的增强作用，将菌根接种的增强能力表征为菌根强化指数，其计算公式如下：

图 3 不同铜或镉处理下油松分泌耐热蛋白量 Fig.3 Thermostable protein content exuded by Pinus tabulaeformis under different Cu or Cd treatments

在Cu和Cd胁迫下，菌根强化指数均大于零，说明菌根接种增强了寄主植物的抗重金属胁迫能力. 随着重金属添加浓度的增加，菌根强化指数呈现先增加后减少的趋势， 在Cu 50 mg ·kg-1和Cd 0.75 mg ·kg-1处理下，强化指数达到最高(图 4).

图 4 不同铜或镉处理下菌根强化指数 Fig.4 Mycorrhizal intensifying index under different Cu or Cd treatments

2.3 铜镉在根系细胞和根际耐热蛋白中 的分布

用根际耐热蛋白或油松根系细胞中的重金属含量与初始投加量的比值，表示相对固持量，以分析铜镉在根系细胞和根际耐热蛋白中的分布. 从图 5可以看出，过量Cu和Cd胁迫下，无论是Cu处理还是Cd处理，接种显著增加了根际耐热蛋白中重金属的相对固持量(P<0.05). 在Cu处理下，接种油松根际耐热蛋白和根系细胞中重金属总相对固持量是未接种的1.81～2.75倍，且在接种处理下，根际耐热蛋白(TTP)中Cu的相对固持量是根系细胞的4.19～43.00倍，远远大于根系细胞中Cu的固持量 (P<0.05)[ 图 5(a)].

Cd处理也具有相似的结果，说明根系分泌耐热蛋白在固持根际环境中过量重金属中起着非常重要的作用. 但随着Cd浓度的增大，耐热蛋白(TTP)和根细胞中Cd的相对固持量都呈现减小的趋势[ 图 5(b)].

图 5 不同铜或镉处理下耐热蛋白与根系细胞中重金属的相对含量 Fig.5 Relative content of heavy metals in TTP and root cell under different Cu or Cd treatments

3 讨论

在过量Cu和Cd的胁迫下，接种显著增加了油松根际耐热蛋白的分泌量，这一结果与Zheng等[17]在研究Xerocomus chrysenteron接种油松幼苗根系分泌物中水溶性蛋白分泌量增加的实验结果一致. 已有研究表明，菌根植物对重金属胁迫具有显著的耐受性[18]. Wang等[19]在研究中发现，接种丛枝菌根真菌的烟草地收割后，土壤中球囊霉素相关土壤蛋白的总量增加,进一步的分析显示球囊霉素相关土壤蛋白中含有大量的重金属. Morselt等[20]的研究也证明了，外生菌根真菌可以通过分泌金属结合蛋白来抵御重金属的胁迫. 因此，外生菌根对重金属胁迫有较高耐受的原因，可能是外生菌根分泌的耐热蛋白具有固持重金属的作用. 在本研究中，2.19%～3.43%的总Cu添加量以及14.3%～29.1%的总Cd添加量存在于耐热蛋白中，而本实验室前期研究结果显示，在重金属胁迫下，接种了Xerocomus chrysenteron的松苗的生长状况得到明显地改善，且根际土壤中重金属的有机结合态含量显著增加[21, 22]. 上述结果显示，菌根分泌物中耐热蛋白固持了大量的外加重金属，降低了过量重金属的生物有效性，从而减轻了其对植物的毒害作用. 因此，在重金属胁迫下，菌根真菌诱导根系分泌物中对重金属具有固持能力的耐热蛋白量的增加，可能是菌根植物适应土壤环境变化的重要机制之一.

与未接种油松相比，接种油松根系细胞中Cu的含量是未接种的0.85～2.53倍，在Cu 50 mg ·kg-1处理下，接种油松根系细胞中Cu的含量低于未接种，这一结论与以往的研究结果相矛盾[23]. Cu作为必需元素，一方面，接种有利于菌丝体向土壤中延伸，增加了根系的吸收表面积，使植物根细胞能获得更多的Cu[24～26]. 另一方面，重金属会破坏未接种根系的原生质膜，导致重金属离子大量进入植物体内，菌根通过保护原生质膜从而减少根系对重金属的吸收[27]. 这两方面因素共同作用可能使得在Cu 50 mg ·kg-1处理下，接种油松根系细胞Cu含量低于未接种油松. Cd处理条件下，接种油松根系细胞中Cd的含量是未接种的1.58～1.88倍，Cd不是植物生长的必需元素，但对一些化合物的巯基以及植物新陈代谢中的磷酸基具有很强的亲和性[28]，很容易被植物吸收[29]，具有强烈的植物毒害作用，少量的镉就会对植物造成严重的危害. 所以，虽然根系分泌耐热蛋白固持了大量的Cd，但是菌根并没有阻止Cd进入植物体内[23],随着Cd添加浓度的增加，被菌丝吸收的Cd还是会进入植物根系内. 有研究表明，植物根系细胞中金属螯合物多聚甘氨酸能够将重金属结合在植物根部[30,31]，接种可能增加了根系细胞中多聚甘氨酸的含量[32]，从而导致根部重金属的含量大于非菌根植物.

对比图 5可以看出，必需元素Cu在耐热蛋白中的相对固持量显著小于有毒元素Cd. 这种差异是否由耐热蛋白中氨基酸种类和结构的差异性所导致，还需要对耐热蛋白的序列做进一步测定后，再做分析.

4 结论

(1)纯培养条件下，外生菌根真菌接种油松分泌耐热蛋白的含量随着时间发生显著性变化，且在第4周耐热蛋白分泌量达到最大值，但接种和不接种之间，耐热蛋白的分泌量并没有显著差别.

(2)Cu和Cd的胁迫下，外生菌根真菌接种油松分泌耐热蛋白的含量显著高于未接种油松，说明重金属胁迫诱导了接种油松分泌耐热蛋白.

(3)Cu和Cd的胁迫下，外生菌根真菌接种油松根际耐热蛋白和根系细胞中重金属的总固持量显著高于未接种油松，且绝大多数重金属被固持在耐热蛋白中，初步探明了耐热蛋白在固持根际重金属中起着非常重要的作用.

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