2014, Vol. 
近年来，水体富营养化日趋严重，因此国家在“十二五节能减排规划”中，又新增了氨氮减排指标，全国的氨氮总量减排目标是10%[1]. 城市污水厂作为减排的主要载体之一，却面临着冬季低水温(＜12℃)条件下，微生物活性受抑制，生物硝化、 反硝化效果不佳，出水水质不能稳定达标等问题.
膜生物反应器(membrane bioreactor，MBR)作为一种新型高效的污水处理技术，与传统活性污泥法(conventional activated sludge，CAS)相比，具有出水水质好、 污泥产率低、 占地面积小、 有机物容积负荷高等优点. 由于MBR实现了水力停留时间(HRT)和污泥龄(SRT)的完全分离，其较长的泥龄有利于世代生长周期长的生物菌群生长和累积，从而有较好的脱氮效果. 因此，在“十二五”污水厂升级改造的提案中，MBR工艺得到了广泛关注[2]. 有研究表明[3]，在常温条件下，MBR比CAS有更好的有机物和氨氮去除效果； 此外，胡怡杉等[4]在贫营养条件下对比了MBR和CAS污泥微生物群落结构，发现MBR污泥中菌群的多样性、 物种丰度和均匀度更高，在贫氧环境下能够保持长期稳定的状态，可见MBR工艺抗环境因素变化能力更强. 而在冬季低温条件下，MBR工艺中微生物群落特征的变化以及微生物耐寒性能的提升却少有研究.
近年来，越来越多的分子生物学手段被应用于研究污水处理过程中微生物群落结构的特性，如变性梯度凝胶电泳(DGGE)、 克隆文库、 高通量测序技术等[5,6,7]. 454焦磷酸高通量测序法是一种以DNA扩增的乳胶系统和皮升大小焦磷酸为基础的高通量测序技术，具有分析结果准确、 高速、 读长长等特点[8]，被广泛应用于污水处理过程中微生物群落结构和多样性的研究[9, 10]. 本研究以冬季低温条件为背景，结合工艺的运行情况及出水水质，利用454焦磷酸高通量测序对MBR系统和传统活性污泥系统中的微生物群落结构进行了解析，并对系统中生物脱氮相关微生物的类群进行了鉴定.
本实验对比了冬季低温下(2012-12-01~2013-02-20，平均水温：5.9℃±2.7℃)3套生物污水处理工艺(R1、 R2、 R3)，其中R1、 R2为小试规模的AO-MBR工艺，均已稳定运行一年以上. 好氧段放置聚偏氟乙烯平板膜，平均孔径为0.2 μm，R3为上海市某水质净化厂推流式A2/O工艺. 3套工艺的进水均为城市生活污水(旋流沉砂池出水)，平均进水水质：化学需氧量(463±167)mg ·L-1，总氮(47.05±11.62)mg ·L-1，氨氮(35.95±9.21)mg ·L-1. 3套工艺的主要运行参数见表 1.
 | 表 1 主要运行参数表 1) Table 1 Operating conditions of R1，R2，R3 |
常规分析项目为化学需氧量(COD)、 总氮(TN)、 氨氮(NH+4-N)、 硝酸盐氮(NO-3-N)，亚硝酸盐氮(NO-2-N)、 总悬浮固体(MLSS)、 挥发性悬浮固体(MLVSS). 均采用国标[11]方法测定.
比硝化速率(SAUR)的测定：将污泥加入到1 L的广口瓶中，加入适量的氯化铵使混合液初始NH+4-N浓度为25 mg ·L-1左右，投加适当的碱度(本实验用NaHCO3)调节pH在7~8. 采用微孔曝气机控制溶解氧(DO)为5~6 mg ·L-1，每隔20~30 min从广口瓶中取混合液并过滤，连续取样3 h以上. 测定滤液的NH+4-N，将NH+4-N的值与时间作直线，直线斜率的绝对值即是污泥的硝化速率值(AUR). 该值与测定使用的MLVSS的比值即是比硝化速率(SAUR).
比反硝化速率(SNUR)的测定：将污泥加入到密闭容器中，加入适量的碳源和氮源(本实验用乙酸钠和硝酸钾)，使混合液溶解性COD和NO-3-N浓度分别为300 mg ·L-1和25 mg ·L-1左右. 实验开始前用氮气吹脱5 min去除水中的溶解氧，然后封闭瓶口. 每隔20~30 min从容器中取混合液并过滤，连续取样3 h以上. 测定滤液的(NO-2-N+NO-3-N)，将(NO-2-N+NO-3-N)与时间作直线，由直线斜率的绝对值得到反硝化速率值(NUR). 该值与测定使用的MLVSS的比值即是比反硝化速率(SNUR).
DNA的提取与PCR扩增：分别取R1、 R2、 R3好氧段污泥混合液(取样时间与比硝化速率和比反硝化速率的时间同步，为1月下旬). 使用E.Z.N.A Soil DNA试剂盒(美国OMEGA Biotek公司)抽提基因组DNA，DNA的抽提和含量测定参见文献[14]. 提取的基因组DNA用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测. PCR扩增区域为细菌16S rRNA的V1-V3区，合成带有“5′454A、 B接头-特异引物3′”的融合引物，其中A为测序端需加标签，B端引物可共用. 细菌16S rRNA的引物名称及引物序列分别是：533R：5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′(测序端)； 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′. PCR采用TransGen AP221-02: TransStart FastPu DNA Polymerase(中国TansGen公司)，20 μL反应体系：5×FastPfu Buffer，4 μL； 2.5 mmol ·L-1 dNTPs，2 μL； 5 μmol ·L-1 533R，0.8 μL； 5 μmol ·L-1 27F，0.8 μL； FastPu Polymerase，0.4 μL； 模板DNA，10 ng. 用GeneAmp9700型(美国ABI公司)PCR扩增仪扩增，反应程序：先95℃ 预变性2 min； 然后进行25个循环(95℃ 变性30 s，55℃ 退火30 s，72℃ 延伸30 s)，最后72℃ 延伸5 min. 用AxyPreDNA凝胶回收试剂盒(美国AXYGEN公司)回收PCR产物，经Tris-HCl洗脱后，用2%琼脂糖凝胶电泳检测. 根据电泳结果，将PCR产物用QuantiFlourTM-ST蓝色荧光定量系统(美国Promega公司)进行定量，按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合.
454文库构建与测序：应用高通量测序平台454 GS FLX Titaniu(美国Roche454公司)对扩增产物进行焦磷酸测序. 测序结束后将测序接头及引物序列去除，并对处理后的有效序列进行数据及长度分布统计. 为提高后续生物信息分析的准确性，对有效序列进行优化，包括：① 利用特异性引物信息将非特异性扩增片段序列去除； ② 丢弃长度短于150 bp、 含有模糊碱基(Ns)、 引物碱基含2个以上错配、 单碱基重复超过6个的序列.
生物多样性与分类学分析：首先将序列按照彼此的相似性归为操作分类单元(OTU). 为了降低OTU错分的概率，将优化序列截齐(截取长度：150 bp)，与SILVA106库比对后，对序列进行聚类. OTU聚类利用MOTHUR软件(http://www.mothur.org/wiki/Main_Page)，聚类相似性为97%与95%. 对优化序列采用随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建稀释性曲线. 利用MOTHUR软件对样本Chao丰度指数(http://www.mothur.org/wiki/Chao)，Shannon多样性指数(http://www.mothur.org/wiki/Shannon)及测序深度指数Goods coverage(http://www.mothur.org/wiki/Coverage)进行计算. 在进行分类学分析时，为了提高比对速率与质量，同时保证分类学分析的高可信性，将优化序列截取前400 bp的序列，再根据SILVA106库中的参考序列对OTU进行种属鉴定，种属比对的可信度阈值设定为80%.
工艺R1、 R2、 R3在冬季低温条件下对氮(TN、 NH+4-N、 NO-2-N、 NO-3-N)的去除效果如图 1所示. 从中可知，R1、 R2、 R3工艺系统出水TN的平均去除率分别为85.24%、 56.05%、 58.75%，NH+4-N的平均去除率分别为99.7%、 99.7%、 59.7%. 对比MBR工艺(R1、 R2)和传统工艺(R3)可知，传统活性污泥法的硝化效果较差，出水TN主要以NH+4-N的形式累积，说明冬季低温运行时该工艺系统内的硝化菌对温度较为敏感，而在MBR系统中，对比R1和R2，NH+4-N均有很好的去除，出水NH+4-N均小于0.2 mg ·L-1，可见MBR工艺在冬季低温下仍能保持较好的硝化效果，而R1和R2的出水TN却有显著的差异，主要体现在NO-3-N上，工艺R1的污泥龄较长，有利于反硝化菌的世代生长，此外工艺R1的污泥浓度较高，使得TN的污泥负荷降低，由于微生物群聚效应，出水TN有较好的去除. 将3套工艺进行整体对比，只有工艺R1能稳定达到一级A排放标准，由此可见，在冬季低温条件下，生物脱氮受温度、 污泥龄、 污泥负荷的共同影响，而高浓度的MBR污泥有较好的耐寒特性和有机物去除效果. 以下结合微生物活性(包括SAUR和SNUR)作进一步分析.
 | 图 1 工艺R1、 R2、 R3出水水质对比 Fig. 1 Effluent quality of R1，R2，R3 |
由表 2可知， 3套工艺低温条件下的SAUR为：R2＞R1＞R3，这与工艺出水水质的结果是相吻合的，即MBR工艺的硝化效果优于传统活性污泥法. MBR工艺在夏季时微生物的比硝化速率分别为0.073 7 kg ·(kg ·d)-1、 0.071 5 kg ·(kg ·d)-1，可见MBR污泥在冬季低温条件下仍能保持较高的硝化速率，而在低温条件下，传统活性污泥的硝化速率[0.034 7 kg ·(kg ·d)-1]却远远低于夏季的硝化速率[0.111 0 kg ·(kg ·d)-1]，由此可知，传统活性污泥法的硝化菌活性受温度的影响较大，这与刘长青等[15]研究低温对倒置A2/O脱氮除磷系统影响的结果是一致的，即温度下降到13℃以下时硝化效果明显变差. 此外，从比反硝化速率来看：R3＞R1＞R2，这与工艺出水水质并不相符，主要是由于3套工艺的污泥龄和污泥负荷不同所致，通过计算得到3种工艺的反硝化速率，R1、 R2、 R3分别为：0.780 0、 0.282 5、 0.274 2 kg ·(kg ·d)-1，这一结果与工艺出水水质吻合，可见MBR的长泥龄、 高污泥浓度以及微生物的群聚效应能有效提升生物脱氮效果. 此外，基于笔者此前的研究结果，夏季3套工艺的SNUR分别为：0.062 5、 0.058 8、 0.122 5 kg ·(kg ·d)-1，与冬季低温相比反硝化速率并没有明显的差异，可见比反硝化速率受温度和季节的影响较小，而延长污泥龄、 降低污泥氮负荷是提升生物反硝化效果的关键.
| 表 2 工艺R1、 R2、 R3系统中微生物活性分析 Table 2 Microbial viability of R1，R2，R3 |
综合系统出水水质和微生物活性分析可以得出，冬季低温运行状况下，MBR具有优于传统活性污泥法的硝化效率，且MBR具有泥龄长、 污泥浓度高、 抗冲击能力强的特点，因此更能适应低温环境，此外MBR较高的污泥浓度补偿了低温条件下污泥活性的下降，从而保证了出水水质的相对稳定.
通过对3组样品16S rRNA基因文库进行焦磷酸测序，经修剪去杂后，R1、 R2、 R3分别获得9 334、 8 687、 9 505条优化序列，序列平均长度473 bp. 将优化序列截齐后与SILVA106库比对后进行聚类，在97%的相似性下分别获得了2 610、 2 595、 2 281个OTU，R1、 R2、 R3的稀释性曲线如图 2所示，可见当测序序列数量大于6 000时仍有新的OTU被测出，利用焦磷酸测序法可以获得丰富的生物信息； R1、 R2、 R3的稀释曲线均随测序序列增加趋向平坦，说明本研究中R1、 R2、 R3样本取样量合理. 表 3列出了Alpha-diversity分析中各样品的多样性指数. Chao指数是估计群落中含OTU数目的指数，用于计算菌群的丰度，可表明当测序序列趋向无穷时获得的OTU数量，可见在相似性为97%时，有Chao指数：R2＞R3＞R1，Chao指数的大小与实际获得的OTU数目并不完全对应，可能的原因是样品间测序深度的差异. Shannon多样性指数常用来表征微生物群落的物种多样性，微生物多样性由大到小依次是：R2、 R1、 R3.
 | 图 2 R1、 R2、 R3样品的稀释性曲线 Fig. 2 Rarefaction curve of sample R1, R2, R3 |
| 表 3 R1、 R2、 R3的物种丰富度和多样性评价 Table 3 Richness and diversity estimators of the bacteria in sample R1, R2, R3 |
相似性为97%时样品OTU分类学结果如图 3所示，R1、 R2、 R3聚类后分别包含19、 17、 18个已知菌门，在3组样品中，Proteobacteria菌门均是最主要的菌门，Bacteroidetes菌门次之. 此外R1、 R2、 R3中分别有266、 253、 140条序列不能被分入已知菌门，说明这些细菌可能是未知菌种，相比传统活性污泥法，MBR样品中微生物种群的未知性更高. 在当前分类水平下，两组MBR污泥样品(R1、 R2)在生物群落的结构和丰度上具有比较明显的相似性，而传统的A2/O污泥样品(R3)与它们有较大的差异，如在R1、 R2中，Acidobacteria菌门、 Chloroflexi菌门、 Nitrospirae菌门、 Planctomycetes菌门等均是比较主要的菌门，但在R3中上述细菌的相对丰度很低(小于1%). Nitrospirae菌门被认为与活性污泥硝化作用密切相关[16]，Proteobacteria菌门、 Firmicutes菌门可能与污泥反硝化作用有关[17]. 为了得到更详细的微生物群落组成并获得样品中对生物脱氮起作用的细菌种类，下文将对微生物进行更深入的细分.
 | 图 3 R1、 R2、 R3群落结构分析图 (分类到门) Fig. 3 Bacterial communities at phylum level of sample R1, R2, R3 |
根据SILVA106库中的参考序列对进行菌属鉴定，对比可信度阈值设定为80%，将相对丰度小于1%的菌属合并到其他，分析结果如图 4(a)所示. 通过比对共鉴定出434个已知微生物菌属，其中主要菌属共24个. 从图 4(a)可以看出，R1、 R2菌群的多样性和未知性均高于R3. 对比R1、 R2可以发现采用同一工艺的污水处理装置中微生物群落组成具有一定的共性，但由于污泥负荷、 泥龄等操作条件不同，R1、 R2菌群的微生物种类及分布仍存在差异. 硝化过程是由氨氧化细菌(AOB)将氨氮转化为亚硝酸盐氮，再由亚硝酸盐氧化细菌(NOB)将亚硝酸盐氮氧化为硝酸盐氮实现的. AOB主要包括Nitrosomonas、 Nitrosopira； NOB主要包括Nitrobacter和Nitrospira[18]. 本研究中主要的硝化细菌为Nitrospira菌属，在R1、 R2、 R3中的相对丰度依次为：1.05%、 1.15%、 0.06%. 相对NOB，AOB的丰度非常低，Nitrosococcus(0.01%、 0%、 0%)，Nitrosomonadaceae uncultured(0.16%、 0.46%、 0.09%)，Nitrosomonas(0%、 0.03%、 0%). Ye等[16]在研究硝化反应器和污水处理厂的微生物群落时也出现了这一现象，他们发现采用RDP算法进行分类学分析时约有15%的Nitrosomonadales被错分到与之序列非常接近的Burholderiales中，在本研究中造成AOB低丰度的原因尚不明确. 有研究表明，活性污泥中与反硝化作用有关的主要菌属包括：Azoarcus菌属、 Thauera菌属、 Zoogloea菌属、 Rhodocyclus菌属、 Dechloromonas菌属、 Rhodobacter菌属、 Comamonas菌属等[19~21]. 在本研究中，也发现了Zoogloea(2.16%、 1.93%、 7.91%)、 Thauera(1.6%、 0.96%、 2.7%)、 Comamonadaceae uncultured(1.26%、 0.99%、 2.32%)以及Comamonas(0.23%、 0.2%、 0.29%)等可能参与反硝化作用的细菌类群. 此外，R1、 R2和R3中还包括丰度较低的Rhodobacter(0.04%、 0.05%、 0.05%)和Dechloromonas(0.51%、 0.39%、 0.94%).
 | 图 4 R1、 R2、 R3的系统发育分析及硝化菌、 反硝化菌丰度 Fig. 4 Phylogenetic analysis of sample R1, R2, R3 and the relative abundance of dominant nitrifier and denitrifier |
图 4(b)是本研究中获得的硝化细菌和反硝化细菌的丰度图，除了丰度较大的硝化菌(Nitrospira)和反硝化菌(如Zoogloea、 Thauera)，丰度较小的AOB(如Nitrosococcus、 Nitrosomonadaceae uncultured)和反硝化菌(如Rhodobacter、 Dechloromonas)也各自合并到硝化细菌和反硝化细菌中. 硝化菌总丰度依次为：1.22%、 1.64%、 0.15%. 硝化细菌的生长受到温度、 pH、 溶解氧等环境因素的限制，由于MBR污泥具有泥龄长，生物群落结构变化快等特点，这使其生物群落具有更好的适应环境因素变化的能力[3]，从而有可能为生长周期长、 对环境敏感的硝化细菌存活生长提供有力的保证. MBR中较高的污泥浓度和硝化菌丰度确保体系中较高的硝化菌数量，从而使MBR在低温环境硝化菌活性下降时仍具有较好的硝化效果. 反硝化菌总丰度依次为：5.8%、 4.52%、 15.21%，这与R1、 R2、 R3的SNUR大小相吻合. 反硝化过程受碳源、 硝酸盐浓度、 温度、 溶解氧等因素共同影响，R3反硝化菌总丰度远大于R1、 R2，但由于R3污泥浓度低、 氮负荷高，且R3硝化效果较差使得体系中缺少足够的NO-3-N为反硝化提供电子受体，从而限制了反硝化过程，因此R3的TN去除效果较差. 相反由于R1泥龄长，较高的污泥浓度补偿了反硝化菌丰度的不足，保证出水水质良好.
(1)低温条件下， R1，R2，R3工艺系统出水TN的平均去除率分别为85.24%、 56.05%、 58.75%，NH+4-N的平均去除率分别为99.7%、 99.7%、 59.7%. 比硝化速率： R2＞R1＞R3，比反硝化速率：R3＞R1＞R2，表明高浓度MBR污泥具有更好的耐寒特性和氨氮去除效果，保证出水水质的稳定.
(2)焦磷酸测序的结果表明，相似性为97%时，丰富度：R2＞R3＞R1，多样性：R2＞R1＞R3； MBR污泥的未知性高，微生物群落的组成和丰度与CAS系统有较大不同；
(3)对微生物群落的系统发育细化分析表明，本研究中主要的硝化菌属为Nitrospira，总相对度依次为：1.22%、 1.64%、 0.15%； 主要的反硝化菌属为Zoogloea、 Thauera、 Comamonadaceae及Comamonas，总相对丰度依次为：5.8%、 4.52%、 15.21%.
(4)低温环境下，泥龄长、 污泥浓度高、 TN负荷低的MBR系统有利于硝化、 反硝化细菌累积，提升生物脱氮效果.
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