环境科学  2014, Vol. Issue (3): 979-986   PDF    
引用本文
张顺, 田晴, 汤曼琳, 李方. 磷回收对厌氧/好氧交替式生物滤池蓄磷/除磷的影响[J]. 环境科学, 2014, (3): 979-986.
ZHANG Shun, TIAN Qing, TANG Man-lin, LI Fang. Effect of Phosphorus Recovery on Phosphorous Bioaccumulation/Harvesting in an Alternating Anaerobic/Aerobic Biofilter System[J]. Environmental Science, 2014, (3): 979-986.
磷回收对厌氧/好氧交替式生物滤池蓄磷/除磷的影响
张顺, 田晴 , 汤曼琳, 李方    
东华大学环境科学与工程学院, 上海 201620
收稿日期: 2013-7-6; 修订日期: 2013-9-9.
基金项目： 国家自然科学基金项目（20906011）；留学回国人员科研启动基金项目（11W11329）；上海市自然科学基金项目（102R1401200）
作者简介：张顺(1988~),男,硕士研究生,主要研究方向为废水生物处理,E-mail:871306454@qq.com
通讯联系人,E-mail:tq2004@dhu.edu.cn
摘要：为能提高生物除磷系统的除磷/回收磷效率，研究采用厌氧/好氧交替式生物滤池（AABF）处理低碳磷比废水，观察利用周期性扩增进水碳源进行磷回收时，生物滤池除磷效率及生物膜内微生物特性的变化. 通过分析生物滤池除磷效率变化，生物膜多聚物染色、扫描电镜（SEM）观察以及荧光原位杂交（FISH）技术分析生物滤池系统实施周期性磷回收对生物膜内微生物菌群形态与组成的影响. 结果发现，生物滤池在先后经历3次生物蓄磷-磷回收（PB-PR）的运行操作过程中，生物滤池除磷效率分别由磷回收前的60.3%、82.9%、86.6%提高到磷回收后的87.2%、91.2%、93.5%；生物滤池生物膜内优势菌群形态逐渐由大球菌演变为小球菌、杆菌与丝状菌；经过连续3个周期的PB-PR操作，生物滤池底部生物膜中聚磷菌所占比例由43%提高至70%；聚磷菌群在生物膜内混合菌群中的比例随着上流式生物滤池高度的增加而不断提高. 结果表明，采用周期性的碳源扩增与回收磷的操作，可以提高生物滤池除磷效率；引起生物滤池生物膜内微生物菌群形态与组成发生变化，促进聚磷菌成为优势菌群.
关键词： 生物滤池     碳源扩增     磷回收     微生物群落     FISH    
Effect of Phosphorus Recovery on Phosphorous Bioaccumulation/Harvesting in an Alternating Anaerobic/Aerobic Biofilter System
ZHANG Shun, TIAN Qing , TANG Man-lin, LI Fang    
College of Environmental Science and Engineering, Donghua University, Shanghai 201620, China
Abstract: To improve the phosphorus (P) removal/recovery efficiency of a biological P removal system, the study used an alternating anaerobic/aerobic biofilter system to treat synthetic domestic sewage with a low carbon (C) to P ratio. The effects of using periodical carbon source amplification for P recovery on the P removal efficiency and the microbial characteristics within the biofilm were investigated. Intracellular storage polymer dyeing, scanning electron microscopy (SEM) observation and fluorescence in situ hybridization (FISH) methods were employed to characterize the changes of microbial communities in the biofilm during three continuous operation cycles of P bio-accumulating-P recovery (PB-PR). The results showed: through three cycles of operation process of PB-PR, the P removal efficiency of biofilter was increased from 60.3%,82.9%,86.6% (before P harvesting) to 87.2%, 91.2%, 93.5% (after P harvesting), respectively; the dominant microbial community morphotypes within the biofilter transformed from big cocci to small cocci, bacilli and filamentous and the group of phosphate-accumulating organisms (PAOs) got rising predominance, which was increased from 43% to 70% after three times of PB-PR; the proportion of PAOs in the biofilm increased unceasingly with the height of the up-flow biofilter. The results showed that the periodical carbon source amplification could improve the P removal efficiency of the biofilter and help the PAOs to become the dominant bacteria within the biofilm.
Key words: biofilter     carbon source amplification     phosphorus recovery     microbial community     FISH    

磷是水体富营养化的直接诱因[1, 2]，也是一种不可更新、 难以替代的自然资源[3, 4]. 在此情况下，开发污水磷回收工艺已成为各国专家的研究热点[5]. 2012年9月在哈尔滨举办的IWA有关废水氮、 磷去除与回收的国际会议加速了磷回收技术的研发与应用.

在实际工程中，污水强化生物除磷-磷回收(enhanced biological phosphorus removal- phosphorus recovery，EBPR-PR)工艺多基于活性污泥法系统，其普遍面临碳源(COD)不足、 污泥膨胀以及污泥容易流失等问题[6]； 生物膜法的特点在于微生物固着生长，结合紧密、 不会出现污泥膨胀、 剩余污泥量少等优点[7]，利用附着生长的生物膜法EBPR工艺能够有效避免活性污泥法的各项弊端. 郝晓地等[8]已证实磷回收能够强化低碳源污水脱氮除磷效果，如果将生物膜法EBPR工艺与磷回收联用，处理效果势必会进一步提高. 但目前生物膜法EBPR工艺的研究仅限于运行条件、 处理效果优化等方面，针对生物膜法除磷/蓄磷-磷回收联用工艺的研究及报道非常有限，仅有日本Kodera等[9]新近报道了利用改良生物膜法进行厌氧/好氧交替富集废水中磷用于磷回收的探索性研究. 而国内仅有王凤蕊等[10]报道了利用生物滤池技术进行生物除磷/蓄磷，并正在研究与开发生物膜法蓄磷-磷回收的联用工艺.

在生物膜法EBPR工艺中，主要是应用聚磷菌(phosphate-accumulating organisms，PAOs)[11]厌氧释磷/好氧超量吸磷的生理特性，达到去除水体中磷元素的目的[12]. 所以生物膜中聚磷菌的种类及数量决定了强化除磷工艺的除磷效率[13, 14]. 过去人们常用菌种分离培养鉴定法[15,16,17]来研究生物膜中的微生物菌群， 但这种方法对一些培养条件苛刻或不能被培养的细菌却没有多大作用，最重要的是它不能精确地反映混合菌群的组成和多样性. 荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization，FISH)的发展为这方面的研究提供了有力的工具，应用FISH 技术对聚磷菌进行研究在一定程度上可以真实地反映出聚磷菌在生物膜内部的组成和空间分布情况. 它已成为检测聚磷菌最有效的途径之一[18,19,20].

因此，本研究在厌氧/好氧交替式生物滤池(AABF)蓄磷、 除磷过程中，采用周期性扩增进水碳源进行磷回收时，生物滤池除磷效率的变化，并通过多聚物染色、 扫描电镜(SEM)观察及荧光原位杂交(FISH)技术考察磷回收对生物滤池生物膜内微生物菌群的形态与组成的影响.

1 材料与方法
1.1 实验装置

实验装置为交替式厌氧/好氧生物滤池(AABF)，整套装置主要由生物滤柱、 进水水箱、 中间水箱、 控制箱、 电磁阀以及空气压缩机等组成. 实验装置主体生物滤池为有机玻璃材质的滤柱，高2.1 m，内径100 mm，壁厚8 mm，填料为粒径2~4 mm的石英砂，其装填高度为1.15 cm，总填充量为3.75 kg(干重)，生物滤池运行初期的孔隙率为28.9%，实际水位1.2 m，水面高出石英砂层约0.05 m，顶部设置电磁阀用来控制生物滤池与空气的连通状态. 滤柱上共设置有10个取样口，分别为5个水样取样口和5个生物膜取样口，交替排列于滤柱柱体上，水样取样口与滤柱底座距离分别为0.2、 0.4、 0.6、 0.8和1.0 m. 实验装置如图 1所示.

图 1 实验装置示意 Fig. 1 Schematic of the experimental system

进水水箱(C1)贮放人工配置的污水，厌氧阶段，C1的出水流入上流式生物滤池(B1)经过厌氧释磷后排入中间水箱(C2)，好氧阶段则将C2里的水重新回流到B1内进行好氧吸磷过程后排出，空气压缩机负责好氧阶段曝气，时间控制箱在设定好的时间条件下完成对各开关的开启与关闭. 整套系统的运行流程如图 2所示.

图 2 厌氧/好氧生物滤池运行流程示意 Fig. 2 Schematic of the anaerobic/aerobic biofilter system C1.进水水箱； C2.中间水箱； B1.生物滤池； P1.厌氧进水
水泵； P2.好氧进水水泵； P3.空气压缩机； T1~T4.电磁阀
1.2 运行条件

实验采用模拟生活污水作为生物滤池的进水，进水配方如表 1所示.

表 1 模拟生活污水进水组分 Table 1 Influent composition of the simulated sewage water

生物滤池厌氧/好氧交替循环周期(CD)为8 h，其中厌氧3 h，好氧5 h(前2 h内循环). 进水流量为3.5 L ·h-1，水力停留时间约为50 min.

连续监测3个生物蓄磷-磷回收(P bio-accumulating-P recovery，PB-PR)周期内生物滤池的进出水水质(每天监测一个CD)，每隔10 d进行一次磷回收(采用扩增进水碳源方式诱导生物滤池内聚磷菌群充分释磷，形成高浓度的磷回收液、 便于后续磷回收)，磷回收时配水方案如表 2所示. 磷回收方式为：进水→静置1 h→排水，重复数次，收集磷回收液进行结晶实验来回收污水中的磷[21].

表 2 磷回收时进水组分 Table 2 Influent composition during the P recovery process

1.3 监测项目与分析方法

实验中监测的项目包括:生物滤池进、 出水(包括生物滤池沿程出水)TOC、 TP、 电导率、 ORP、 pH、 温度、 生物膜MLSS和MLVSS、 生物膜含磷量等[10].

1.4 参数含义及计算方法

式中，ηpr为磷回收时磷释放率(%)； TPca为每个PB-PR周期内蓄磷总量(mg)； TPpr为磷回收时释放磷量(mg).

式中，ηTP为总磷去除率(%)； TPi为每天进入生物滤池的磷量(mg)； TPe为每天流出生物滤池的磷量(mg).

式中，ηTOC为TOC去除率(%)； TOCi为每天进入生物滤池的TOC量(mg)； TOCe为每天流出生物滤池的TOC量(mg).
1.5 生物膜特性分析
1.5.1 多聚物染色及SEM分析

生物膜样品的PHB检测采用苏丹黑+蕃红及尼罗红染色. 经苏丹黑染色后，PHB颗粒呈蓝黑色，而细胞质等呈红色； 经尼罗红染色后，细胞内PHB发出橙色或浅红色的荧光[22, 23]. 生物膜样品中异染粒(poly-P)的检测采用阿氏(Albert)异染粒染色法，染色后，poly-P呈黑色，其他部分呈暗绿或绿色. 多聚物染色样品用荧光显微镜(Nikon Eclipse 80i，Japan)观察，每个样品拍摄10~15张图片. 扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM) (JEOL-5600SL, Japan)用于分析生物膜样品中的微生物群落形态.

1.5.2 FISH分析

荧光原位杂交(FISH)技术用来分析生物滤池中聚磷菌(PAOs)的含量，实验所用探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供. 实验中所用到的寡核苷酸探针如表 3所示.

表 3 细菌和聚磷菌的寡核苷酸探针 Table 3 Oligonucleotide probes for bacteria and PAOs

本实验中EUB338用异硫氰酸荧光素(FITC)标记，FITC激发后显绿色； PAO(462、 651、 846)及GAMA42a用Cy5标记(此为PAO混合探针，简记为PAO探针)，Cy5激发后显红色[26]. EUB338探针用来检测全菌，PAO(462、 651、 846)探针用来检测β-Proteobacteria中红环菌属(Rhodocyclus)相关的PAOs，GAMA42a探针用来检测γ-Proteobacteria中假单胞菌属(Pseudomonas)相关的PAOs. 杂交后样品用激光共聚焦显微镜LSM 510 META (Zeiss，Germany)观察，每个样品拍摄3~5张图片，拍摄的FISH图片用Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics，America)软件来分析生物膜样品中聚磷菌所占的比例.

2 结果与分析
2.1 生物滤池运行状况

2.1.1 每个PB-PR周期内磷的变化情况

从图 3中可以看出，每个PB-PR周期内的TPca分别较上个周期提高了42.4%和9.4%； TPpr分别较上个周期提高了14.8%和16.4%. 综合分析：每个PB-PR周期内TPca增加，表现为每次实施磷回收后，生物滤池好氧段出水磷浓度减小，生物滤池运行状况变好. 3次PB-PR操作中ηpr平均为37.7%，如果磷结晶实验时磷的沉淀效率按95.0%计算，则可知本系统磷的总回收效率为35.8%.

图 3 每个PB-PR周期内磷的变化情况 Fig. 3 Change of P in each PB-PR cycle cl：磷回收液磷浓度(mg ·L-1)
2.1.2 磷回收对磷、 碳去除率的影响

从图 4(a)可以看出：在每个PB-PR周期内，生物滤池厌氧释磷液磷浓度不断升高，最高释磷量达到74.80 mg ·L-1； 结合图 4(a)和图 4(b)可以看出：在每个PB-PR周期内，生物滤池出水中磷的浓度不断升高，生物滤池对磷的去除率也不断降低. 经过3次PB-PR周期的运行，生物滤池好氧末出水磷浓度分别由磷回收前的7.58、 3.69、 2.48 mg ·L-1减小到磷回收后的1.43、 0.50、 0.49 mg ·L-1； ηTP分别由磷回收前的60.3%、 82.9%、 86.6%提高到磷回收后的87.2%、 91.2%、 93.5%. 可以推断，周期性扩增进水碳源用于磷回收对于恢复聚磷菌的除磷能力是一个行之有效的手段. 分析认为：磷回收促进吸磷饱和聚磷菌胞内的磷被释放出来，恢复其超量吸磷的能力. Yoshino等[29]的研究表明：在BNR系统中，排放部分污泥厌氧消化池中的上清液用于磷回收，可以提高BNR系统的除磷效率. 从图 4(a)和图 4(b)中还可以看出，第3个PB-PR周期内，生物滤池出水磷浓度稳定在1.00 mg ·L-1左右，ηTP保持在85.0%以上. 分析认为：随着生物滤池的不断运行，生物滤池内聚磷菌的数量不断增加，经过10 d运行，生物滤池内聚磷菌还未达到摄磷极限，因此能够保证系统的除磷效率.

图 4 磷回收对磷、 碳去除率的影响 Fig. 4 Effect of phosphorus recovery on the removal rate of P and C 虚线位置为磷回收点

从图 4(c)和4(d)可以看出，厌氧、 好氧阶段TOC的数据差别不大，ηTOC均保持在85.0%以上，说明TOC的去除主要是在厌氧阶段. 分析认为：厌氧阶段，PAOs分解体内poly-P 为能量吸收废水中的易降解碳源以合成胞内储能物质聚羟基烷酸(PHAs)； 好氧阶段，PAOs利用贮存的PHAs作为能源和碳源，吸收废水中的磷以合成poly-P[30].

2.1.3 生物滤池沿程出水中磷的变化情况

图 5为生物滤池3次磷回收前后沿程出水中磷的变化. 从中可以看出：底部取样口的释磷和吸磷效果均比较差，平均释磷量为29.40 mg ·L-1，磷的去除率平均为34.8%； 而中部和上部取样口的平均释磷量分别为44.45 mg ·L-1和42.88 mg ·L-1，磷的去除率分别为82.6%和83.3%. 生物除磷过程中的除磷效率往往取决于生物膜内的聚磷菌含量与数量，因此分析认为：下部生物膜中微生物活性较弱或者聚磷菌在生物膜菌群内所占比例较低，中部生物膜中微生物活性和聚磷菌比例较高，上部生物膜较少.

图 5 生物滤池沿程出水中磷的变化情况 Fig. 5 Change of effluent P along the height of biofilter
2.2 生物膜形态与组成变化分析

本研究在生物滤池运行期间的第10 d、 第20 d和第30 d，分别收集生物滤池厌氧/好氧阶段末不同取样口的生物膜样品，并对收集的样品进行微生物特性分析.

2.2.1 微生物形态与组成在时间上的变化

从图 6可以看出：在生物滤池运行期间内，微生物的形态与组成会发生较大变化. 图 6 (a1)中微生物群落主要由大球菌构成，图 6 (a2)中则主要为小球菌及短杆菌，图 6 (a3)中微生物群落的细菌形态进一步变小，结合紧密，同时丝状菌增多[其余图同图 6(a)的说明]. 这说明：在蓄磷周期的开始阶段，生物滤池内生物膜数量较少，进水中的碳源和营养物质充足，微生物在维持自身生长繁殖的同时吸收进水中的碳源和营养物质，把它们转变为自身的能量存储物质贮存在自身体内，因此微生物的形态较大. 随着生物滤池的运行时间的增加，生物滤池内微生物数量不断增多，生物滤池系统的有机负荷率(F/M)不断下降，造成进水中的碳源和营养物质不能满足微生物的生长与繁殖，贮存在细胞体内的能量储存物质逐渐被消耗，微生物的形体逐渐减小. 随着生物滤池的不断运行，生物滤池内微生物数量不断增多，同时微生物代谢产物不断积累，生物膜内微生物菌群结合越来越紧密，菌胶团内部呈细长丝状态的丝状菌的数量不断增多，且丝状菌菌丝伸出菌胶团外，以便能够获取污水中的营养物质[31].

图 6 不同取样时间及取样口生物膜样品中PHB、 poly-P染色及SEM照片 Fig. 6 PHB, poly-P staining and SEM images of bottom biofilm samples at different sampling times 图片矩阵中第1、 2、 3列分别代表第10 d、 第20 d和第30 d所取的生物滤池生物膜样品，第1、 3、 4、 5行代表
生物滤池底部取样口生物膜样品，第2行代表生物滤池中部取样口生物膜样品，(a)代表生物膜样品的PHB染色照片， (b)、 (c)、 (d)分别代表生物膜样品的poly-P染色、 尼罗红染色及SEM照片
2.2.2 微生物形态与组成在空间上的变化

由图 6 (a)的染色结果也可以看出：在不同高度上，生物滤池内微生物的形态结构也不太一样. 下层微生物菌落结合紧密，存在大量的丝状菌，菌群内分布有少量大球菌； 上层微生物菌落结构较下层松散，丝状菌较少，更多的是形态较小的球菌和杆菌. 生物滤池沿程不同高度微生物形态不一样也是由于不同高度微生物所获得的基质(有机物、 氮、 磷等)浓度不同，所造成生长条件不一样引起的.

2.2.3 聚磷菌比例的变化

由图 6 (c)可以观察到，随着生物滤池生物PB-PR操作的不断运行，poly-P颗粒不断地增多，这说明生物滤池内聚磷菌数量在不断地增多，聚磷菌的比例也在不断地增大[32]. 由图 6 (a)及图 6 (b)的染色结果也能发现这一现象.

2.3 FISH结果分析

图 7为不同取样时间生物膜样品的FISH照片. 图中绿色荧光信号为FITC标记的EUB338探针杂交的结果，红色荧光信号为Cy5标记的PAO探针杂交的结果，图 7(a3)为图 7(a1)、 图 7(a2)结合后的图，其中黄色信号代表的是聚磷菌[其余图同图 7(a)的说明]. 图 7的FISH照片用Image-Pro Plus 6.0软件分析可知，生物滤池底部生物膜中聚磷菌所占比例分别为43%、 54%、 70%. 说明随着生物滤池的不断运行，生物滤池内微生物数量不断增加，聚磷菌所占比例也不断的增加，生物滤池内的聚磷菌群不断地得到纯化； 这与图 3中每个PB-PR周期内磷的吸收量也是相对应的. 第3个PB-PR周期，生物滤池底部和中部生物膜中聚磷菌所占比例分别为70%、 80%. 说明生物滤池中部生物膜中聚磷菌的含量比底部生物膜中聚磷菌的含量高，这与图 5的结果也是相对应的.

图 7 不同取样时间及取样口生物膜样品FISH照片 Fig. 7 FISH images of biofilm samples at different sampling times and sampling spots
3 结论

(1) 采用周期性的碳源扩增进行磷回收可以促进聚磷菌胞内所富集的磷被释放出来，恢复聚磷菌超量吸磷的能力，从而改善生物滤池的除磷效率.

(2) 周期性的碳源扩增能够引起生物滤池生物膜内微生物的形态与组成发生较大变化，促进聚磷菌逐渐成为优势菌群.

(3) 经过3个PB-PR周期的运行操作，聚磷菌在生物膜内混合菌群中的比例随着上流式生物滤池高度的增加而不断提高.

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