2014, Vol.35 
邻苯二甲酸酯类化合物(phthalate esters，PAEs)，包括邻苯二甲酸二甲酯(DMP)、 邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、 邻苯二甲酸二正丁酯(DBP)、 邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)、 邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)和邻苯二甲酸丁基苄酯(BBP)，广泛应用于塑料工业、 医用产品、 化妆产品中，常作为塑化剂来提高塑料制品的柔韧性. 邻苯二甲酸酯类化合物对动物有致癌、 致畸和致突变性以及具有较强的内分泌干扰性效应、 生殖毒性等[1, 2]. 近年来，由于各类水体、 土壤和大气中都检测出较高浓度的PAEs，在水生和陆生动物及人体中均有报道检测出PAEs，对生态环境和人体健康构成了极大危害，PAEs的环境污染问题已成为国际环境化学优先研究领域.
蚯蚓是土壤生态系统中类群最大的生物，是陆生生物与土壤生态环境信息传递的桥梁. 由于蚯蚓在土壤中普遍存在并且能积累大量有机和无机污染物[3,4]，因此，蚯蚓在土壤污染的生态毒理学研究中承担着重要角色[5]. 赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)在标准土壤毒理试验中常作为一种模式生物，是陆地生态毒理学研究的优先生物种[6]，其中LD50的测定是蚯蚓生态毒理学研究常见的方法，污染物对蚯蚓组织酶活力的影响能更早地指示污染物的毒害水平，因此，蚯蚓组织酶活力的变化常作为土壤早期预警指标对土壤生态风险进行监测. 李文英等[7]的研究发现DBP对斑马鱼肝脏、 鳃中SOD酶活有明显影响. DEHP对赤子爱胜蚓的细胞具有抗氧化损伤继而改变了组织酶的活性[8]. 由此，开展PAEs物质对土壤生物生长作用的毒理学研究，对监测PAEs类有机污染物的污染风险预测和诊断有着十分重要的意义.
本研究测定了DMP、 DEP和DBP对赤子爱胜蚓的急性毒性效应，探讨了DMP、 DEP和DBP对蚯蚓组织超氧化物歧化酶(SOD)、 过氧化氢酶(CAT)和乙酰胆碱酯酶(AChE)活性指标的影响，旨在为此类有机物的环境安全性评价、 探索监测土壤生态系统有机物污染的生态指标以及为揭示该类化合物对土壤生物的毒性机制提供科学依据.
赤子爱胜蚓(Eisenia foetida)购置于浙江省金华市的蚯蚓养殖场. 试验选择体重在300~400 mg，环带明显，大小相近的成年蚯蚓.
试验使用的自然土壤采自浙江工业大学屏峰校区后山，采集0~20 cm的表层土壤. 其中该土壤的pH值为6.8，粗砂含量5%，细沙含量10.4%，粉砂含量66.9%，黏土含量4.7%，土壤含水率为20%.
邻苯二甲酸酯类DMP、 DEP、 DBP和丙酮均为分析纯. 超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、 过氧化氢酶(CAT)试剂盒和乙酰胆碱酯酶(AChE)试剂盒均由南京建成生物研究所提供.
台式高速冷冻离心机(Labofuge 400R，德国)，分光光度计(UV1000，上海天美科学仪器有限公司)，酶标仪(SpectraMax M2，美国)，数显恒温水浴锅(H. H. S21-4，金坛市万华实验仪器厂).
预试验将蚯蚓(Eisenia foetida)分别经DMP和DEP染毒暴露48 h后，找出最小致死浓度MLD和最大致死浓度LD100，在此区间内设置一系列浓度梯度进行试验. DMP浓度：0、 60、 100、 140、 180、 220、 260 μg ·cm-2; DEP浓度：0、 40、 80、 120、 160、 200、 240 μg ·cm-2.
根据预试验结果设置试验浓度. DMP浓度：0、 600、 1400、 2200、 3000 mg ·kg-1; DEP浓度：0、 1000、 1800、 2600、 3400 mg ·kg-1.
本试验采用自然土壤法，根据蚯蚓暴露在DMP、 DEP、 DBP污染土壤中的急性毒性效应结果设置浓度，DMP浓度：0、 50、 250、 1250 mg ·kg-1; DEP浓度：0、 40、 200、 1000 mg ·kg-1. DBP浓度：0、 30、 150、 750 mg ·kg-1.
参考中华人民共和国国家标准发布的蚯蚓对化学品急性毒性试验[9]中所描述的方法，进行滤纸法急性毒性试验. 试验用直径为15 cm的培养皿，每个培养皿的底部垫有一张直径为15 cm的滤纸，用丙酮溶解暴露物配成系列浓度梯度的溶液，均匀洒在滤纸上(3 mL的溶液可以将直径为15 cm的滤纸均匀地润湿)，空白对照组直接将3 mL丙酮均匀地洒在滤纸上. 在通风厨中待丙酮挥发干后加入蒸馏水打湿滤纸，将清肠1 d的蚯蚓放入培养皿中，用扎了洞的保鲜膜封口，置于空调房中培养，温度控制在为(22±2)℃、 湿度约为75％的条件下培养，并定期补水保湿. 每一处理组3个平行，每个平行分别加入10条体重、 大小相近的蚯蚓(约350 mg)，以溶剂丙酮污染为空白对照. 每隔12 h观察一次，记录蚯蚓的死亡数，并记录蚯蚓的病理症状和行为，试验中以机械刺激蚯蚓的头部和尾部，均无反应则视为死亡. 在暴露期间注意清除死掉的蚯蚓，防止污染对其他蚯蚓的影响.
土壤法急性毒性试验方法参照中华人民共和国国家标准发布的蚯蚓对化学品急性毒性试验[9]的方法，蚯蚓的培养基质为无PAEs污染的自然土壤. 试验用1 L的烧杯，丙酮溶解暴露物配成系列浓度梯度的溶液，在通风橱中将不同浓度的暴露物溶液加入200 g已自然风干的土壤，空白对照组直接加入与处理组相同体积(约5 mL)的溶剂丙酮，充分混匀后置于通风橱中挥发12 h，然后加入125 mL的蒸馏水充分混匀后平衡24 h，将在湿润滤纸上清肠1 d的蚯蚓放入土壤中，然后用扎了洞的保鲜膜将烧杯封口，防止蚯蚓逃逸，定期补充水分保持培养基质的湿度，并每周添加8 g牛粪(养料). 将蚯蚓置于空调房中培养，温度控制在(20±2)℃，光暗比为12 h/12 h，于第2、 7、 14和28 d取出蚯蚓，测定蛋白含量和酶活.
先将研钵，研棒和蚯蚓匀浆缓冲液放于冰上预冷. 将第2、 7、 14、 28 d 从试验组中取出的蚯蚓清肠1 d后称重，加入9倍体积的蚯蚓匀浆缓冲液(50 mmol ·L-1 Tris，1 mmol ·L-1 DTT，1 mmol ·L-1 EDTA，250 mmol ·L-1 蔗糖，pH 7.6)，在冰上研磨，制成10%的组织匀浆液. 将匀浆液转入1.5 mL的EP管，于已预冷至4℃的离心机中9000 r ·min-1离心15 min，吸取上清液至一新的EP管立即测定蛋白含量和酶的活性，或在-80℃冰箱保存备用. 以上操作均在4℃下进行.
采用SPSS l7.0软件的单因素方差分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著，多重比较分析采用LSD法.
SOD酶活单位定义为：每mL反应液中SOD抑制率达50%时所反应的SOD量为一个SOD活力单位(U); CAT酶活单位定义为：每g血红蛋白中或每g组织蛋白中过氧化氢酶(CAT)每s分解吸光度为0.50~0.55的底物中的过氧化氢相对量为一个过氧化氢酶的活力单位(U); AChE酶活单位定义为：每mg组织蛋白在37℃保温6 min，水解反应体系中1 μmol基质为一个活力单位(U).
如图 1所示，当处于培养皿中污染暴露(浓度≥180 μg ·cm-2)24 h后蚯蚓机械刺激反应迟缓，对光照的敏感度减弱，蚯蚓活动的周围有黄色体液的痕迹，部分蚯蚓体色加深，身体出血，生殖环带肿大，尾部呈现串珠状，还有断尾现象.
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图 1DMP通过滤纸法接触对蚯蚓形态学的影响Fig.1 Effects of DMP on morphology of earthworms by paper contact method |
如图 2所示，DEP对蚯蚓的中毒症状与DMP相同(浓度≥160 μg ·cm-2),24 h后蚯蚓身体松软，机械刺激时反应迟缓，对光照的敏感度也减弱，蚯蚓活动的周围有黄色体液的痕迹，部分蚯蚓体色变黑，身体出血，生殖环带明显肿大，尾部呈现串珠状，还有断尾现象.
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图 2DEP通过滤纸法接触对蚯蚓形态学的影响Fig.2Effects of DMP on morphology of earthworms by paper contact method |
如图 3所示，随着浓度的升高和暴露时间的延长，蚯蚓的死亡率相应地升高. 用SPSS软件分析，在12、 24、 36和48 h时DMP的LD50分别为214.612、 160.213、 141.810、 129.603 μg ·cm-2. 空白对照组的蚯蚓培养48 h后仍没有出现死亡现象，浓度为100 μg ·cm-2的培养皿中培养12 h后，蚯蚓开始出现死亡现象，死亡率为16.67%，浓度为260 μg ·cm-2的培养皿中培养48 h后，蚯蚓的死亡率达到了100%. 用SPSS软件分析，在12、 24、 36和48 h时DEP的LD50为241.367、 186.107、 162.475、 145.336 μg ·cm-2. 空白对照组的蚯蚓培养48 h后仍没有出现死亡现象，当把 蚯蚓放入浓度为40 μg ·cm-2的DEP中培养12 h后，蚯蚓开始出现死亡现象，死亡率为3.33%，当DEP的浓度为240 μg ·cm-2时培养36 h后，死亡率达到100%.
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图 3蚯蚓暴露于不同浓度的DMP和DEP时在12、 24、 36和48 h的死亡率Fig.3Relationship between the mortality of E. fetida and their exposure to different concentrations of DMP and DEPafter 12,24,36,48 h exposures |
如图 4所示，随着浓度的升高和暴露时间的延长，蚯蚓的死亡率明显相应地升高，活着的蚯蚓身体变软，行动迟缓，有的蚯蚓出血、 断尾. 用SPSS软件分析，DMP污染蚯蚓7 d和14 d时的LD50为2221.785和1560.120 mg ·kg-1. 空白对照组的蚯蚓培养14 d后仍没有死亡现象; 蚯蚓在浓度为600 mg ·kg-1的烧杯中培养14 d后开始出现死亡现象. 用SPSS软件分析，DEP污染时蚯蚓7 d和14 d的LD50为3272.014和1516.186 mg ·kg-1. 空白对照组的蚯蚓培养14 d后仍没有死亡现象; 蚯蚓在浓度为1000 mg ·kg-1的烧杯中培养7 d后开始出现死亡现象.
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图 4蚯蚓暴露于不同浓度DMP和DEP在7 d和14 d的死亡率Fig.4Relationship between the mortality of E. fetida and their exposure to different concentrations of DMP and DEP after 7 d and 14 d exposures |
如图5(a)所示，在不同DMP暴露浓度下SOD酶的活性先升高再降低，部分处理组酶的活性变化显著(P<0.05). 从图5(b)中可以看出，DEP单一污染的土壤中，相对于空白对照组，各处理组中蚯蚓体内SOD酶活性总体均被激活，且活性的变化与污染物的浓度具有相关性，SOD活性随着DEP浓度的增加而逐渐升高. DBP单一污染土壤中各浓度处理组中，蚯蚓体内SOD酶活性出现明显波动，部分处理组与对照组活性相比差异性显著(P＞0.05). 如图5(c)所示，在整个试验过程中，SOD酶活性均表现为低浓度抑制，且随着浓度的升高，SOD酶活性逐渐升高，暴露28 d时各处理组与空白组SOD酶活性基本持平.
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图 5DMP、 DEP和DBP对蚯蚓体内SOD酶活性的影响Fig.5Effects of DMP,DEP and DBP on the SOD activity of earthworms |
如图6(a)所示，在整个试验过程中，DMP各处理组的CAT活性较空白对照组均表现为先抑制后升高，且t为14、 28 d时抑制效应比t为2、 7 d时强. 如图6(b)所示，在不同DEP暴露浓度下，蚯蚓体内的CAT酶活性有显著变化，当t为2、 7 d时，相对空白对照组CAT酶活性均表现为抑制现象，且随着浓度的增加，酶的活性逐渐降低; 当t为14、 28 d时，相对空白对照组，CAT酶活性表现为先激活后抑制. DEP处理组的CAT活性于14 d时活性达到最大诱导，污染暴露持续到28 d时CAT活性又有所降低. DBP单一污染对蚯蚓体内CAT酶活性的影响如图6(c)所示，在整个试验过程中，与空白对照组相比，各处理组CAT活性均表现为低浓度激活，随着DBP浓度的增加，CAT活性逐渐降低，部分处理组的酶活性变化显著(P＜0.05). CAT活性随暴露时间的延长呈先上升后降低的趋势，在第7和14 d时激活效应最大.
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图 6DMP、 DEP和DBP对蚯蚓体内CAT酶活性的影响Fig.6Effects of DMP,DEP and DBP on the CAT activity of earthworms |
蚯蚓暴露在DMP单一污染土壤中，体内AChE酶活性变化如图7(a)所示，在整个试验过程中，相对于空白对照组，AChE酶活性表现为低浓度激活高浓度抑制的变化趋势. 如图7(b)所示，在不同DEP暴露浓度下AChE酶活性有显著变化，在整个试验过程中，各处理组AChE酶活性相对于空白对照组，表现出低浓度抑制且随着DEP浓度的增加酶活性逐渐升高的变化趋势，到28 d时活性有恢复至对照组水平的趋势. 蚯蚓在不同DBP暴露浓度下，在整个试验过程中AChE酶活性先降低再升高，如图7(c)所示，随着暴露时间的增加，酶活性逐渐得以恢复，至28 d时各处理组与空白对照组均无显著差异.
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图 7DMP、 DEP和DBP对蚯蚓体内AChE酶活性的影响Fig.7Effects of DMP,DEP and DBP on the AChE activity of earthworms |
滤纸接触法染毒能快速、 简便地给出污染物的毒性信息，然而在实际环境中，污染物对蚯蚓的毒性不仅与其固有毒性有关，还与其在土壤中的环境化学行为及生物有效性密切相关，因此，用土壤染毒来模拟蚯蚓生活的真实环境可真实地反映污染物在环境中的实际影响. 本研究通过滤纸接触法测得DMP对蚯蚓的毒性大于DEP，这可能与两者的化学结构有关，DMP的皮肤渗入效应比DEP强，该结果与Annette等[10]的报道相一致. 本研究通过自然土壤法测得DMP和DEP对蚯蚓的急性毒性效应结果与Annette等[10]的报道相一致，他们报道了土壤法BBP、 DOP等4类PAEs的LC50值均在1064~3335 mg ·kg-1之间. 滤纸接触法和自然土壤法均未得出DBP的LC50，这可能是由于DBP侧链较DMP和DEP长，水溶性较低，难以渗透进入蚯蚓的皮肤和细胞内，因此没有表现出急性毒性效应. 通常，PAEs类化合物的毒性大小随着其碳链的加长而增大，而对于烷基链长至少6个碳的高分子量PAEs，结果显示出毒性随着分子量的增大而降低，在水生生物和部分陆生生物的毒性试验研究中，已有大量的研究结果都证实了这种相同的毒性效应[11, 12, 13]. 目前，国内外就PAEs类物质对蚯蚓的毒性研究较少，对于采用滤纸法的研究更是鲜见，本研究的结果为DMP、 DEP和DBP对蚯蚓急性毒性的剂量响应关系提供了数据基础.
在正常的生理条件下产生，生物体内活性氧的产生和抗氧化防御系统酶之间存在动态平衡机制，当生物体受到逆境胁迫时，可引起生物体的氧化应激反应，产生超氧阴离子自由基O-2. 超氧阴离子自由基具有极强的氧化能力，是生物氧毒害的重要因素之一. 生物体的抗氧化防御系统酶有SOD、 CAT和POD，其中SOD天然存在于生物体内，是一种能清除细胞中超氧自由基的金属酶类，可以催化过氧化物歧化为H2 O2和O2，其催化反应为O-2＋O-2＋2H+ H2 O2＋O[14]2，歧化反应的产物H2 O2是代谢过程中产生的一种活性氧废物，它仍能够对机体造成损害，为了避免这种损害，H2 O2必须被快速地转化为其他无害或毒性较小的物质，而CAT就是常被细胞用来催化H2 O2分解的工具[15]，其催化转化反应为：2H2 O2 2H2 O+O2. SOD活力对氧化压力有敏感的指示作用[16, 17]，在存在氧化压力时，SOD和CAT可有效清除生物体内过量的活性氧，维持活性氧代谢平衡，共同作用完成保护机体的功能，使生物体在一定程度上可以忍耐、 减缓或抵抗逆境胁迫，因此，研究抗氧化酶活性变化是生物体在逆境胁迫下很重要的一项生理指标.
PAEs在生物体内的代谢过程可诱发活性氧自由基的大量产生，由此引起的氧化胁迫已在不同生物体内得到了证实. 秦洁芳等[18]研究DBP对翡翠贻贝体内SOD活性的影响，表明SOD活性变化符合生物免疫机能的作用规律：在较低浓度和暴露中期酶活性被诱导，随着DBP浓度升高和胁迫时间的延长导致酶活性下降. 本试验对于SOD的研究有类似的结果，如图5(a)所示，SOD酶活性较空白组先升高，这是因为蚯蚓在遭受逆境胁迫时，产生的氧自由基数量增多，SOD保护系统打开，刺激了SOD的合成来清除氧自由基，减少细胞膜的过氧化作用，这是生物体对污染的适应性反应[19]，而随着暴露浓度的升高，SOD合成的速度不能跟上机体内氧自由基增加的速度，自由基产生和消除之间的平衡已经被破坏，最终导致机体细胞膜系统过氧化，使SOD酶活性降低，丁草胺和乙草胺对蚯蚓SOD酶活性的影响也表现为先诱导后抑制的趋势[20]. 蚯蚓在DEP的逆境胁迫过程中，产生超氧阴离子自由基O-2，因为要清除体内的氧自由基O-2，SOD活性随着自由基的增多而被诱导增加，且活性的变化与污染物的浓度具有正相关性，说明暴露物DEP浓度在其耐受性限度内，高浓度DEP胁迫产生数量更多的氧自由基O-2，刺激更多的SOD合成. 蚯蚓暴露在DBP低浓度处理组中，SOD活性受到抑制，原因可能是DBP胁迫初期蚯蚓抗氧化应激作用的延迟：在低浓度暴露下，尚不足以诱导SOD产生，却先对酶蛋白产生了破坏或消耗所致. 刘文丽等[21]研究异丙甲草胺对蚯蚓酶活性的影响，发现SOD活性有相同的变化，秦洁芳等[18]研究DBP对翡翠贻贝体内SOD活性的变化也发现了这种抗氧化应激作用延迟的现象. 随着DBP浓度的升高，胁迫程度增加，SOD被诱导合成，在第28 d时SOD活性回升至空白对照水平，表明此时机体已对暴露物的逆境胁迫表现出了一定的耐受性.
蚯蚓暴露于低浓度DMP时，也表现出了抗氧化应激作用的延迟现象，低浓度组CAT活性被显著(P<0.05)抑制，蚯蚓体内CAT活性尚未被诱导而酶蛋白被破坏或消耗，从而导致CAT酶活性降低，随着DMP浓度的升高，暴露胁迫造成蚯蚓体内H2 O2产生并含量增加，从而诱导CAT活性逐渐增加. CAT参与调控细胞内的H2 O2，其中一部分来自PAEs在蚯蚓体内的转化过程，另一部分来自SOD的歧化产物，由图5(b)可知DEP暴露前期(2 d和7 d)细胞内来自SOD的歧化的H2 O2含量高，细胞中H2 O2过量，CAT活性受到抑制，随着DEP浓度的增加，使细胞受到胁迫加重，CAT活性抑制程度增加，在暴露后期(14 d和28 d)SOD的激活效应减弱，低浓度组中蚯蚓可以通过提高CAT活性来清除机体内的H2 O2，能够维持体内平衡，但随着DEP浓度的增加，来自SOD的歧化的H2 O2含量逐渐升高，CAT活性逐渐降低甚至抑制. 蚯蚓受到DBP污染胁迫时，细胞中产生的H2 O2增多，CAT被诱导合成来清除H2 O2以减轻和阻断脂质过氧化反应，但在高浓度DBP污染下产生的H2 O2含量升高，使CAT活性降低或抑制[22]，这可能与污染因素使CAT与H2 O2相互作用而降低酶的活性，直至某一临界浓度使其活性受到抑制有关. 由图5(c)可知DBP低浓度作用下，细胞内来自SOD歧化的H2 O2含量低，CAT活性被诱导，随着DBP浓度的增加，SOD歧化的H2 O2含量增加，细胞受到胁迫加重，CAT活性降低或抑制.
AChE是一种重要的神经系统酶，它在神经信号传导中起着重要作用，当污染物扰乱机体正常功能时，AChE是评价污染物对神经系统毒害作用有效、 快速的方法. Venkateswara等[23]发现当蚯蚓暴露于久效磷时AChE被抑制，且抑制与其浓度呈正相关. Venkateswar等[24]也发现农药毒死蜱在其LC50 浓度暴露时可引起蚯蚓体内AChE活性降低，并随着时间的延长对AChE的活性抑制率逐渐增高. 此外，Yamin等[25]发现杀虫剂(OP)对不同动物的AChE活性也表现出抑制效应. 这与本试验结果并不完全一致，与空白对照相比，在低浓度的DMP暴露时AChE活性被诱导，在高浓度时被抑制. 污染物对生物体的AChE活性影响还有受抑制后再被诱导的情况，Kavitha等[26]研究毒死蜱对食蚊鱼脑组织AChE酶活性的影响，发现暴露胁迫96 h后酶活性受到抑制，但暴露胁迫持续16~18 d时，酶活性恢复到对照组水平. 秦洁芳等[27]的研究也发现不同浓度的DEHP对红鳍笛鲷幼鱼脑组织AChE的胁迫效应相似，都表现为先抑制后诱导，在96 h内AChE活性恢复到对照组水平. 本研究的结果与文献[26，27]的研究类似，如图7(b)和7(c)所示，AChE活性较空白对照组均表现出低浓度抑制，产生脂质过氧化作用，增加浓度时酶活性逐渐升高，随着暴露时间延长至28 d时，酶活性逐渐得以恢复至对照组水平或有恢复的趋势，表明本研究中DEP和DBP的剂量并没有超出蚯蚓自我代偿的浓度范围. 本研究与文献[24，25]的结果不同，原因可能是：从酶学指标变化的时间-效应关系看，不同的化合物种类对生物体AChE活性的影响效应具有较大差异性，这可能与污染物在生物体内的代谢途径和能否通过组织血液屏障的机制有很大联系，有待后续试验证实.
生物体的酶系统比较复杂，以酶活性指标作为污染胁迫的生物标记物应考虑多种因素的影响，在进行检测时应将几种酶结合起来进行分析. 自然环境中存在的PAEs类物质含量远低于本研究中设定的剂量，从蚯蚓的酶活性指标变化可知其对土壤生物的毒性较低，但其产量逐年递增，对土壤生态系统中的生物存在潜在危害，对生活在底栖的生物毒害应密切关注. 本研究探讨了DMP、 DEP和DBP对生活在食物链底层的陆生生物蚯蚓抗氧化系统和神经的损伤，这些指标为土壤毒理学研究和PAEs类物质的污染风险预测提供了理论依据.
(1) DMP和DEP对蚯蚓的毒害效应均表现出浓度和时间相关性. 滤纸接触法染毒48 h时，DMP的毒性大于DEP，自然土壤法染毒14 d时，DEP的毒性大于DMP. 滤纸接触法和自然土壤法染毒，DBP对蚯蚓表现出的毒性均小于DMP和DEP.
(2) DMP、 DEP和DBP对蚯蚓组织抗氧化酶SOD、 CAT和AChE响应各不相同，CAT活性影响最大，SOD和AChE次之. DEP和DBP对SOD和CAT的变化影响表现出一定同步性，DEP和DBP诱发产生的H2 O2和SOD的歧化产生的H2 O2，共同诱导和抑制CAT活性. AChE活性变化表现为先抑制后诱导，在28 d时酶活性有恢复的趋势.
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