环境科学  2014, Vol.35 Issue (2): 759-763   PDF    
引用本文
赵艳鸽, 袁兴中, 黄华军, 崔凯龙, 彭馨, 彭子原, 曾光明. 鼠李糖脂逆胶束体系中纤维素酶的后萃研究[J]. 环境科学, 2014, (2): 759-763.  
ZHAO Yan-ge, YUAN Xing-zhong, HUANG Hua-jun, CUI Kai-long, PENG Xin, PENG Zi-yuan, ZENG Guang-ming. Study on the Backward Extraction of Cellulase in Rhamnolipid Reverse Micelles[J]. Environmental Science, 2014, (2): 759-763.  
鼠李糖脂逆胶束体系中纤维素酶的后萃研究
赵艳鸽1,2, 袁兴中1,2, 黄华军1,2, 崔凯龙1,2, 彭馨1,2, 彭子原1,2, 曾光明1,2    
1. 湖南大学环境科学与工程学院, 长沙 410082;
2. 环境生物与控制教育部重点实验室(湖南大学), 长沙 410082
收稿日期: 2013-5-15; 修订日期: 2013-7-24.
基金项目： 国家自然科学基金项目（50978087）
作者简介：赵艳鸽(1990~),女,硕士研究生,主要研究方向为固体废物资源化,E-mail:541539392@qq.com
通讯联系人,E-mail:yxz@hnu.edu.cn
摘要：采用生物表面活性剂鼠李糖脂（rhamnolipid，RL）构建RL/异辛烷/正己醇的逆胶束体系，并研究了该体系中纤维素酶后萃过程的影响因素.分别考察了后萃水相pH值、振荡时间、离子种类和强度以及添加短链醇对纤维素酶的后萃率和酶活回收率的影响.结果表明，后萃水相最佳pH值为7.0，振荡时间以30 min为最佳，后萃水相中离子强度以0.15 mol·L-1 KCl最佳，正丁醇的最佳添加量为2%.在最佳实验条件下，纤维素酶的后萃率和酶活回收率分别可以达到76.22%和93.39%.生物表面活性剂RL构建的逆胶束体系对纤维素酶的后萃效果较佳，且RL具有高生物降解性，低临界胶束浓度等优点，应用前景广阔.
关键词： 逆胶束     纤维素酶     后萃     生物表面活性剂     鼠李糖脂    
Study on the Backward Extraction of Cellulase in Rhamnolipid Reverse Micelles
ZHAO Yan-ge1,2, YUAN Xing-zhong1,2 , HUANG Hua-jun1,2, CUI Kai-long1,2, PENG Xin1,2, PENG Zi-yuan1,2, ZENG Guang-ming1,2    
1. College of Environmental Science and Engineering, Hunan University, Changsha 410082, China;
2. Key Laboratory of Environmental Biology and Pollution Control (Hunan University), Ministry of Education, Changsha 410082, China
Abstract: This paper studied the backward extraction of cellulase in RL/isooctane/n-hexanol reverse micelles system. Several key parameters influencing the backward extraction efficiency and activity recovery of cellulase were investigated, including stripping aqueous pH, stripping time, salt type and ionic strength, and addition of alcohols. The experiment results indicated that the optimal parameter values as follows: stripping aqueous pH 7.0, stripping time 30 min, 0.15 mol·L-1 of KCl, dosage of n-butanol 2%. Under above optimum conditions, the backward extraction efficiency and activity recovery were up to 76.22% and 93.39%, respectively. The backward extraction of cellulase using reverse micelles based on biosurfactant RL performs well. Furthermore, RL has many advantages such as high biodegradability, low critical micelle concentration, etc. The application prospects of RL reverse micelles are extensive.
Key words: reverse micelles     cellulase     backward extraction     biosurfactant     rhamnolipid    

纤维素酶是一类多组分酶系的总称,它们协同作用,分解纤维素产生寡糖和纤维二糖,最终水解为葡萄糖[1].纤维素酶的应用对环境具有重要的意义,选择适宜的分离纯化方法是降低纤维素酶生产成本、 提高纤维素酶活力的主要途径[2].

逆胶束作为一种新型的液-液萃取技术,具有成本低,可以重复利用等优点,近年来备受关注[3].逆胶束是表面活性剂在非极性的有机溶剂中溶解,超过临界胶束浓度(CMC)时自发形成的一种纳米尺寸的聚集体[4].逆胶束萃取包含两个基本步骤:前萃和后萃.在前萃过程中,蛋白质从水溶液转移到逆胶束有机相中,而在后萃过程中,蛋白质从逆胶束中释放,被转移到新的水相,以达到纯化的目的[5].相较于前萃,后萃过程存在很多问题,如反应缓慢,得率不高等,后萃困难是逆胶束萃取技术大规模应用的主要障碍之一[6]. 鼠李糖脂(rhamnolipid,RL)作为一种生物表面活性剂,具有高生物降解性,低毒性等优点,在环境领域得到应用,并被用来代替化学表面活性用于逆胶束萃取[7, 8].

本课题组刘薇等[9]已对纤维素酶在鼠李糖脂逆胶束体系中的前萃过程进行了研究.在此基础上,本研究首先用生物表面剂鼠李糖脂构建了逆胶束体系,并考察水相pH值,振荡时间,离子强度和种类以及添加短链醇对后萃过程的影响,得到最佳的后萃条件,以提高逆胶束对纤维素酶的纯化效率.

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂

生物表面活性剂:单糖鼠李糖脂RL(本实验室自制).油相:溶剂异辛烷(天津市富宇精细化工有限公司)； 助溶剂正己醇(天津市恒兴化学试剂制造有限公司).其他试剂:纤维素酶(上海贝塔生物制品有限公司)； 考马斯亮蓝G250(天津市光复精细化工研究所)； 乙醇(天津市富宇精细化工有限公司)； 正丙醇和异丙醇(天津市风船化学试剂科技有限公司)； 正丁醇(天津市富宇精细化工有限公司).

1.1.2 仪器

紫外分光光度计(Shimadzu UV2550,Japan)； 磁力搅拌器(RT 5 power IKAMAG)； DK-8D型电热恒温水槽,TG16-WS台式高速离心机； 超声波清洗仪； pH计.

1.2 方法
1.2.1 有机相的制备

将一定浓度的酶溶液加入到2.75mmol ·L-1RL/异辛烷/正己醇体系(9 ∶1,体积比)中,超声溶解,得到澄清的含一定浓度纤维素酶的逆胶束溶液.溶液的含水量W0([H2 O]/[RL])控制在30.

1.2.2 后萃

将含一定离子浓度的盐溶液与等体积的有机相混合置于带塞锥形瓶中,磁力搅拌30 min,后置于离心机3000 r ·min-1离心10 min,分相,留取下层水相.采用紫外分光光度法分别测得所得水相中的纤维素酶含量和纤维素酶活.

后萃率(backward extraction efficiency,BEE)定义为:后萃水相中的纤维素酶含量与后萃前有机相中纤维素酶含量的百分比.酶活回收率(activity recovery,AR)定义为:后萃水相中酶活与原酶液酶活的百分比.

1.2.3 测定方法

纤维素酶浓度的测定:采用考马斯亮蓝染色分析法[10].

纤维素酶活的测定:采用3，5-二硝基水杨酸法测定,以羧甲基纤维素钠为底物[11].

2 结果与讨论
2.1 水相pH值对后萃的影响

后萃水相的pH值对后萃效果具有显著的影响,pH值决定纤维素酶分子表面可电离基团的离子化状态,并改变纤维素酶分子和表面活性剂带点极性端之间的静电相互作用[12].纤维素酶是一种两性电解质,当水相pH值高于纤维素酶的等电点(pI)时,纤维素酶分子带负电荷,纤维素酶的等电点为3.5~5.0[13].鼠李糖脂是一种阴离子表面活性剂,形成的阴离子型逆胶束内壁带负电荷,纤维素酶分子与表面活性剂极性头所带电荷性质相同,两者之间存在的静电斥力使逆胶束中的纤维素酶发生后萃[10].图 1反映了后萃水相pH值的变化对纤维素酶后萃率和酶活回收率的影响.后萃条件为: 0.15 mol ·L-1 KCl，30 min，25℃.

图 1后萃水相pH值对后萃率和酶活回收率的影响Fig.1Effects of stripping aqueous phase pH on backward extraction efficiency and activity recovery in backward extraction process

由图 1可知,当pH值为4~7时,随着pH值的增加,后萃率和酶活回收率逐渐提高.当pH=7时,达到最大的后萃率(63.15%)和酶活回收率(94.18%).当pH>7.0时,后萃率有所下降.而酶活回收率迅速下降.这是由于在强碱条件下,纤维素酶的结构被破坏,造成纤维素酶的失活.根据实验结果确定后萃过程水相最佳pH值为7.

2.2 离子种类和强度对后萃的影响

水相的离子强度决定了带电荷的逆胶束的内表面以及带电荷的纤维素酶分子表面被静电屏蔽的程度[12].该现象对逆胶束萃取产生两个方面的影响:一是降低了带电荷的纤维素酶分子与逆胶束带电荷的内表面间的静电相互作用； 二是减少了表面活性剂极性端之间的静电斥力,导致高离子强度下逆胶束内径变小,有机相对水和生物分子的增容作用减少[14, 15].高的离子强度有利于后萃的发生,对于RL这种阴离子表面活性剂构建的逆胶束体系,阳离子强度的影响较大.除了离子强度,离子种类对纤维素酶的行为也具有一定的影响[16].由于每种纤维素酶的特异性,离子种类和浓度的选择至关重要,这不仅会影响纤维素酶的稳定性,更是关系到逆胶束结构的问题[17].本实验选用了NaCl、 KCl、 KBr这3种盐,考察了浓度都从0.05 mol ·L-1逐步增加到0.3 mol ·L-1的过程中,后萃率和酶活回收率的变化.后萃的其它条件为:水相pH值7,振荡时间30 min，25℃.

图 2分别为后萃水相NaCl、 KCl、 KBr浓度的变化对后萃率和酶活回收率的影响.从中可以看出随着离子浓度的增加后萃率和酶活回收率都是先增加后降低.不同的是NaCl、 KCl在浓度增加到0.15 mol ·L-1时后萃效果最佳,而KBr在浓度继续增加到0.20 mol ·L-1时后萃效果最佳.其中NaCl浓度为0.15 mol ·L-1时,后萃率和酶活回收率分别为60.98%和94.27%.相同浓度下,选用KCl的后萃率和酶活回收率分别为63.2%和93.18%.KBr浓度为0.20 mol ·L-1时的后萃率和酶活回收率分别为63.82%和94.98.对比3种盐,KBr效果相对较好,但所需浓度较其它两种盐偏高,NaCl相对最差,KCl效果比较好,只略差于KBr,所以实验水相中盐的种类选用KCl.

图 2后萃水相离子种类和强度对后萃率和酶活回收率的影响Fig.2Effects of salt type and ionic strength on backward extraction efficiency and activity recovery in backward extraction process

相同浓度下,后萃效果K+＞Na+,与离子半径的大小规律一致.这是因为当所带电荷量相同的时,离子半径越大,水化作用就越弱,水壳对于离子和表面活性剂之间的静电相互作用的屏蔽作用就越弱,不利于表面活性剂分子和纤维素酶分子之间的相互作用,从而有利于后萃的进行[18].同时进一步证明了对于阴离子型表面活性剂构建的逆胶束体系,阳离子的影响大于阴离子.

2.3 振荡时间对后萃的影响

后萃过程需要一定的时间完成,并且较前萃过程缓慢,所以振荡时间对纤维素酶的后萃有一定的影响.图 3反映了后萃过程中后萃率和酶活回收率随振荡时间的变化.后萃其它条件是:水相pH值7，0.15 mol ·L-1 KCl，25℃.

图 3后萃振荡时间对后萃率和酶活回收率的影响Fig.3Effects of extracting time on backward extraction efficiency and activity recovery in backward extraction process

图 3表明,随着振荡时间的延长,后萃率和回收率相应提高，30 min时达到最高的后萃率(62.8%)和酶活回收率(92.8%).继续延长时间,后萃过程达到一个平衡状态,后萃率基本保持不变,但酶活回收率逐渐减少,这可能是由于振荡时间过长导致纤维素酶受到破坏,酶活降低[3, 10, 19].因此确定后萃最佳振荡时间为30 min.

2.4 添加短链醇对后萃的影响

一般来说,通过调节后萃水相的pH值和离子强度使其达到不利于纤维素酶萃取的条件,即在以等电点pI为基准,使用与纤维素酶前萃不同的pH范围和较高的离子强度条件下,可以实现纤维素酶的后萃[20, 21, 22].但后萃率普遍较低,甚至有些采用这种办法难以实现后萃.为了强化后萃过程,研究人员提出来很多提高后萃率的方法,其中一种有效并广泛应用的是在后萃水相中添加短链醇[23].作为一种后萃过程中常用的促进剂,醇的选用必须慎重,因为很小的结构变化就会引起纤维素酶的失活[24].本实验选用了乙醇、 正丙醇、 异丙醇和正丁醇这4种短链醇,分别考察了它们对后萃率和酶活回收率的影响.图 4展示了这4种醇的添加对后萃率的影响,图 5反映了4种醇的添加对酶活回收率的影响.后萃其它条件为:水相pH值7,0.15 mol ·L-1 KCl,振荡时间30 min，25℃.

图 4添加短链醇对后萃率的影响Fig.4Effects of added alcohol on backward extraction efficiency in backward extraction process

图 5添加短链醇对酶活回收率的影响Fig.5Effects of added alcohol on activity recovery in backward extraction process

从图 4可以看出,添加少量的短链醇到后萃水相中可以提高后萃率,再继续添加后萃率则会下降,其中除了异丙醇在添加量为6%时后萃率最高,为76.33%.其它的醇都是在添加量为2%时最高,分别为72.28%、 73.15%和76.22%.这是因为醇是一种两亲性分子,在纤维素酶后萃过程中作为一种媒介可以屏蔽纤维素酶与表面活性剂之间的相互作用力同时还能减弱逆胶束之间的相互作用力[17].另一方面,醇能促进逆胶束胶团的形成,所以过量的醇会抑制纤维素酶后萃的进行,导致后萃率下降[25].

由图 5可见,酶活回收率随着醇的添加量的增加而降低,相同添加量时,异丙醇＞正丁醇＞正丙醇＞乙醇,只有在醇的添加量很低时才能保持酶的活性.酶的失活可能与醇加入逆胶束体系后的位置有关,短链醇进入逆胶束胶团的水核中,与酶直接接触而支链醇和长链醇则分散到有机溶剂中[2].所以醇的碳链越短醇让酶失活越严重.根据实验结果,综合考虑后萃率,酶活回收率以及添加量,确定选用正丁醇,添加量为2%.

3 结论

(1)鼠李糖脂逆胶束体系中纤维素酶后萃因素的最优水平:水相pH值7,[KCl]=0.15 mol ·L-1,振荡时间30 min,正丁醇添加量2%.在此条件下,后萃率为76.22%,酶活回收率为93.39%.

(2)萃入鼠李糖脂逆胶束体系中的纤维素酶可以通过控制后萃水相pH值和离子强度来实现后萃,并且在添加少量短链醇的条件下,能获得较高的回收率.由此说明基于生物表面活性剂鼠李糖脂构建的逆胶束体系可以用来纯化纤维素酶.

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