环境科学  2014, Vol.35 Issue (2): 753-758   PDF    
引用本文
龚婵娟, 许晶, 方治国, 楼秀芹, 欧阳志云. 杭州市空气微生物群落碳代谢特征研究[J]. 环境科学, 2014, (2): 753-758.  
GONG Chan-juan, XU Jing, FANG Zhi-guo, LOU Xiu-qin, OUYANG Zhi-yun. Carbon Metabolic Characteristics of Airborne Microbes in Hangzhou[J]. Environmental Science, 2014, (2): 753-758.  
杭州市空气微生物群落碳代谢特征研究
龚婵娟1, 许晶1, 方治国1 , 楼秀芹2, 欧阳志云3    
1. 浙江工商大学环境科学与工程学院, 杭州 310012;
2. 杭州市疾病预防控制中心微生物检验科, 杭州 310021;
3. 中国科学院生态环境研究中心城市与区域生态国家重点实验室, 北京 100085
收稿日期: 2013-6-17; 修订日期: 2013-7-12.
基金项目： 国家自然科学基金青年科学基金项目（41005085）；教育部留学回国人员科研启动基金项目；浙江工商大学研究生科研创新项目
作者简介：龚婵娟(1988~),女,硕士研究生,主要研究方向为空气环境微生物污染,E-mail: raingcj5308778@sina.com
通讯联系人,E-mail:zhgfang77@zjgsu.edu.cn
摘要：利用Biolog技术，研究了杭州市4个样点，即延安路商业街（Yan’an Road Business Street，YRBS）、天目山路与教工路口（Tianmushan Jiaogong Cross Road，TJCR）、浙江工商大学教工路校区（Zhejiang Gongshang University Jiaogong Campus，ZJGUSJC）、西湖曲院风荷（Breeze-ruffled Lotus at Quyuan Garden，BLQG）空气微生物群落碳代谢特征. 结果表明，不同样点空气微生物样品平均颜色变化率（Average Well Color Development，AWCD）在培养240 h后达到稳定，并且4个样点的AWCD值即对单一碳源的利用能力具有显著差异，YRBS>TJCR≈ZJGSUJC>BLQG；YRBS、TJCR、ZJGSUJC和BLQG空气中微生物物种的多样性和丰富度依次减少；不同样点空气微生物对糖类和氨基酸类碳源利用程度较高，对其它碳源利用程度较低，且同一样点对不同单一碳源的利用程度也存在显著差异，YRBS对糖类碳源的利用程度最高，对聚合物类碳源利用程度最低，BLQG对糖类碳源的利用程度最高，对胺类碳源利用程度最低；不同样点空气微生物群落碳代谢基质主成分1（PC1）贡献度为43.8%，主成分2（PC2）贡献度23.4%，YRBS、BLQG和TJCR的空气微生物群落差异较大，碳代谢功能差异显著，而TJCR与ZJGSUJC碳代谢功能无显著差异.
关键词： 空气微生物     碳代谢特征     单一碳源利用     平均颜色变化率     主成分分析    
Carbon Metabolic Characteristics of Airborne Microbes in Hangzhou
GONG Chan-juan1, XU Jing1, FANG Zhi-guo1 , LOU Xiu-qin2, OUYANG Zhi-yun3    
1. School of Environmental Science and Engineering, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310012, China;
2. Microbiology Laboratory, Hangzhou Center for Disease Control and Prevention, Hangzhou 310021, China;
3. State Key Laboratory of Urban and Regional Ecology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
Abstract: Carbon metabolic characteristics in four sampling sites including Yan'an Road Business Street (YRBS), Tianmushan Jiaogong Cross Road (TJCR), Zhejiang Gongshang University Jiaogong Campus (ZJGSUJC) and Breeze-ruffled Lotus at Quyuan Garden (BLQG) in Hangzhou were analyzed using Biolog technology in this study. Results showed that average well color development (AWCD) values were at stationary phase after 240 h cultivation in all four selected sampling sites. Significant differences in sole carbon utilization characterized as AWCD value were found among the four sampling sites, and the highest carbon utilization capacity was observed at YRBS, followed by TJCR and ZJGSUJC, and the lowest at BLQG. The species abundance and diversity of airborne microbes deceased in the order of YRBS, TJCR, ZJGSUJC, and BLQG. In addition, sugar and amino acid utilization capacity of airborne microbes was significantly higher that other carbons sources in all four sampling sites. Significant differences in different sole carbon utilization of airborne microbes in the same sampling site were found. The sugar utilization capacity was the highest, and polymer utilization capacity was the lowest at YRBS. At BLQG, highest sugar and lowest amine utilization capacity was detected. Principal component analysis showed that the contribution of PC1 and PC2 was 43.8% and 23.4%, respectively, in different sampling sites. Significant differences in carbon metabolic characteristics of microbial community in the air were found among YRBS, BLQG and TJCR, and no differences were observed between TJCR and ZJGSUJC.
Key words: airborne microbes     carbon metabolic characteristic     sole carbon utilization     average well color development     principal component analysis    

微生物是空气生态系统中重要的生物组成部分，微生物在空气中的存在与分布一般以人类活动为中心[1]，没有固定的种类，主要通过土壤尘埃、 地面水、 植物、 动物和人类活动等方式被带入空气，以液态和固态粒子的形式存在，在适宜条件下可以直接在空气中繁殖或在沉降基质上繁殖[2]. 空气中广泛分布的细菌、 真菌孢子、 放线菌和病毒等生物粒子不仅与空气环境质量、 空气污染和人体健康密切相关，还具有极其重要的生态系统功能[3, 4]. 空气微生物是生物圈重要的成员，它与自然生态平衡及许多生命现象直接相关，在播种、 授粉和自然界的物质循环以及食物链中起着重要的作用[5]. 由生物粒子组成的气溶胶，可间接作为云凝结核和冰核，导致云滴和冰晶的形成，在雨雪的形成过程中发挥着非常重要的功能，并且可通过直接散射或吸收太阳能辐射在全球气候变化中起着至关重要的作用[6, 7]. 到目前为止，空气微生物学的主要研究内容包括微生物空气污染、 空气中微生物群落结构及影响因子、 空气微生物与人们健康之间的关系[8, 9, 10, 11, 12, 13]，而城市空气微生物功能多样性及碳代谢特征等方面的研究报道很少[14].

Biolog技术可以用于不同环境微生物功能多样性的研究，其主要是利用以群落水平(而不是单一物种)碳源利用类型为基础的Biolog氧化还原技术来表述环境样品微生物群落特征，运用主成分分析(principal component analysis,PCA)或相似类型的多变量统计分析方法展示不同微生物群落产生的不同代谢多样性类型[15, 16, 17]. Biolog技术用于土壤、 水体及根际微生物功能多样性的研究工作较多[18, 19, 20, 21]，而用于空气微生物碳代谢特征的研究工作非常少[22]. 杭州市是浙江省省会和经济、 文化科教中心，长江三角洲中心城市之一，国家历史文化名城和南方典型的风景旅游城市. 作为全球闻名的旅游城市和“生活品质之城”，有关杭州市空气微生物群落结构多样性和功能多样性的研究工作近为空白. 本研究利用Biolog技术系统探讨了杭州市空气微生物碳代谢功能群落结构，针对4个典型样点进行了空气微生物功能多样性差异研究，分析了不同样点空气微生物的碳代谢特征，这对维持空气微生物在城市生态系统中的结构和功能具有重要的理论和实际意义.

1 材料与方法
1.1 研究样点概况

在杭州市4个功能区即商业区、 交通干线、 文教区、 旅游风景区各选取1个观测点，分别选在延安路商业街(Yanan Road Business Street,YRBS)、 天目山路与教工路口(Tianmushan Jiaogong Cross Road,TJCR)、 浙江工商大学教工路校区(Zhejiang Gongshang University Jiaogong Campus,ZJGSUJC)、 西湖曲院风荷(Breeze-ruffled Lotus at Quyuan Garden,BLQG)，于2013年4月进行空气微生物取样工作，4个样点的基本情况如表1所示.

表1 取样点基本概况 Table 1 Basic information of sampling sites

1.2 空气微生物取样器及取样方法

采用法国Bertin*Coriolis μ 空气生物采样器进行取样，Coriolis μ采用全新的气旋式采样技术，空气流速最高可达300 L ·min-1. Coriolis μ能够高效收集空气中的生物样品，样品的采集形式为液体样品，样品后续处理高度灵活，样品可进行稀释和浓缩，以获得更大范围更精确的生物样品信息，用于包括琼脂平板培养在内的多种检测技术. 该取样技术与传统的Andersen法(用琼脂平板收集样品的撞击式空气采样技术)完全不同，样品的收集效果远远优于Andersen法.

空气微生物取样在4个观测点同时进行，每个样点连续取样3 d，每天分别在09:00、 13:00和17:00取样3次，每次取样持续时间为1.5 h，采样高度为人呼吸带，距离地面约1.5 m处，取样流量设置为250 L ·min-1. 空气取样时间每次设定为10 min，取样液为0.9%已灭菌的生理盐水，每次15 mL，10 min一次采样结束后将取样液补充至15 mL进行下一次采样，直至1次取样结束. 采集的样品迅速带回实验室，放入4℃ 冰箱内保存并尽快开展实验研究.

1.3 基于Biolog GN2的微平板操作

选用Biolog GN2进行杭州市不同功能区空气微生物碳代谢特征的研究. 将每个样点每天取样的样品充分混合后接种至Biolog GN2微平板中，每孔接种量为150 μL样品，放入30℃培养箱培养，每隔24 h用Biolog读数器于波长为590 nm处测定光吸收值，直至光密度值稳定为止，总共培养时间为336 h，选取240 h的Biolog平均光密度吸收值进行后续数据的处理.

1.4 计算方法
1.4.1 AWCD值计算

对Biolog 所测的吸光度数据进行平均颜色变化率(average well color development，AWCD)计算，即:

式中，C 是每个孔(光密度测量)的光密度值，R是对照孔的光密度值，n是底
物数量，GN2板中n值为95，然后绘制AWCD 随时间变化的曲线.

1.4.2 空气微生物多样性指数计算

空气微生物多样性指数是从不同方面表现空气微生物群落代谢功能的多样性，Biolog研究中常见的多样性指数如表2.

表2 Biolog分析中的多样性指数 1) Table 2 Biodiversity index in biolog analysis
1.4.3 空气微生物碳源利用率计算

研究空气微生物对碳源利用能力的差异能够了解微生物群落的结构组成. 对照Biolog GN2板碳源类型分布表，确定板中每个孔的碳源类型，其可分为6大类，即糖类(30种)、 氨基酸类(20种)、 羧酸类(24种)、 聚合物类(5种)、 胺类(6种)、 其它类(10种). 根据孔变色情况，确定空气微生物是否对碳源加以利用，每类碳源的利用数目的总和与此类碳源总数的比率即空气微生物碳源利用率.

1.5 统计方法

数据统计和绘图采用Microsoft Excel 2010进行，主成分分析采用SPSS 19.0进行.

2 结果与分析
2.1 碳源平均颜色变化率(AWCD)

AWCD值是从功能代谢水平反映空气微生物群落结构多样性的，是用来衡量空气微生物对单一碳源的利用能力，表现微生物活性的重要指标. 由图 1可知，空气微生物活性随培养时间的延长而有所升高，不同样点AWCD值在24 h以内差异很小，48 h后AWCD值开始升高，72 h后进入指数期，240 h后进入稳定期. 对比不同取样点空气微生物AWCD值发现，不同样点空气中微生物对碳源的利用存在较大差异，其对单一碳源的利用能力大小顺序为：YRBS>TJCR≈ZJGSUJC>BLQG (P<0.01).

图 1不同样点空气微生物AWCD值变化Fig.1 AWCD variation of airborne microbe in different sampling sites
2.2 空气微生物群落功能多样性分析

空气微生物群落功能多样性分析包括Shannon指数、 Shannon均匀度、 Simpson指数、 McIntosh指数、 McIntosh均匀度. Shannon指数是用来估算群落多样性高低的一个指标，它可以评估群落中物种的丰富度； Shannon均匀度是通过Shannon指数计算出的均度，它可以评估物种中个体的相对丰富度，它可以评估物种中个体的相对丰富度； Simpson指数是评估某些最常见种的优势度指数，值越大，表示优势度物种越小，亦表示奇异度越高； McIntosh指数是评价物种多样性的指标之一，与物种丰富度有关； McIntosh均匀度是通过McIntosh指数计算出的均度. 它受物种丰富度的影响较大，也是可以评价物种多样性的指标之一. 由表3可知，杭州市4个样点Shannon指数、 Shannon均匀度、 Simpson指数、 McIntosh指数、 McIntosh均匀度的大小顺序均为YRBS>TJCR>ZJGSUJC>BLQG. 由此可知，YRBS、 TJCR、 ZJGSUJC、 BLQG空气中微生物物种的多样性和丰富度依次减少.

表3 不同样点空气微生物群落功能多样性 Table 3 Diversity and evenness indices for airborne microbial community in different sampling sites
2.3 空气微生物对不同种类碳源利用分析

Biolog GN2微平板含有95种碳源，根据官能团不同可将碳源分为6大类：糖类30种，羧酸类24种，聚合物类5种，氨基酸类20种，胺类6种，其它类10种. 由图 2可知，空气中微生物对糖 类和氨基酸类代谢具有优势，杭州市4个取样点对糖类和氨基酸类碳源利用程度较高，对其它类碳源利用程度较低. 不同样点空气微生物对糖类碳源的利用程度没有显著差异，YRBS、 TJCR、 ZJGSUJC和BLQG的糖类利用率分别为94.5%、 95.5%、 94.4%和90.0%，对胺类碳源的利用程度有显著差异，YRBS、 TJCR、 ZJGSUJC和BLQG的胺类利用率分别为94.4%、 83.3%、 72.2%和55.6%. 同一样点对不同单一碳源的利用程度也存在显著差异. YRBS对糖类碳源的利用程度最高，相对利用率为94.5%，对对聚合物类碳源利用程度最低，相对利用率为80.0%； BLQG对糖类碳源的利用程度最高，相对利用率为90.0%，对胺类碳源利用程度最低，相对利用率为55.6%.

图 2不同样点空气微生物对6类碳源的相对利用率Fig.2 Relative utilization ratio of six groups of carbon sources by airborne microbe
2.4 空气微生物群落代谢功能主成分分析(PCA)

不同样点空气微生物群落碳代谢基质主成分1(PC1)贡献度为43.8%，主成分2(PC2)贡献度23.4%(图 3). 主成分1荷载大于0.55的基质有51种，荷载大于0.85的基质有17种(糖类4种，羧酸类5种，氨基酸类8种)； 主成分2荷载大于0.55的基质只有11种. 因此，不同样点空气微生物碳代谢功能群落结构的差异性主要取决于主成分1中荷载值较高的基质. 由图 3可知，TJCR与ZJGSUJC的类群散点接近，说明两个样点空气微生物群落相近，碳代谢功能无显著差异，而YRBS、 BLQG和TJCR的类群散点距离较大，说明三者的空气微生物群落差异性较大，碳代谢功能差异显著.

图 3不同样点空气微生物对Biolog板中底物碳源代谢主成分分析Fig.3 Patterns of microbial communities in different sampling sites as revealed by Principal component analysis (PCA) of Biolog plate data profiles
3 讨论

空气环境中营养条件贫瘠，严重缺乏微生物生存的基质和营养. 与土壤、 根际和水体微生物相比，空气中微生物的种类、 数量和浓度低很多. 因此，需要利用先进的空气生物粒子取样器来提升单位时间的取样流量，且增加取样时间，这样更能有效的测定空气中微生物的生理活性及碳代谢特征. 本研究利用法国的Bertin*Coriolis μ 空气生物采样器，取样流量最高可达300 L ·min-1，能够较好满足空气中微生物生理活性的测定要求. 试验设置取样流量为250 L ·min-1，每次总取样时间为1.5 h，每次取样空气总量为22.5 m3，4个样点AWCD值在72 h后进入指数期，且有明显的指数期特征，240 h后进入稳定期，进入稳定期后YRBS、 TJCR、 ZJGSUJC和BLQG的AWCD值分别约为1.1、 0.6、 0.6和0.4. 段魏魏等[22]利用液体撞击式取样器(取样时间15 min，流量10 L ·min-1，空气总流量0.15 m3)研究塔克拉玛干沙尘暴源区空气微生物群落代谢特征时发现，5个样点AWCD值120 h后进入指数期，且没有明显的指数期特征，240 h还未达到稳定期，进入稳定期后AWCD值在0.1~0.24值. 此研究中用于表征空气中微生物群落碳代谢能力和生理活性的AWCD值进入指数期和稳定期所需的培养时间比本研究多，且最终的AWCD值明显低于本研究，这与取样的空气总流量及样品的微生物数量密切相关. 然而，土壤样品的AWCD值在24~72 h呈现明显的指数期，192 h样品的AWCD值基本接近饱和(AWCD≥1)，其AWCD值进入指数期和稳定期所需的时间比本研究少，且最终的AWCD值明显高于本研究[22, 24, 25]. 这主要是由于空气中微生物的种类、 数量和浓度明显低于土壤环境，从而导致空气微生物样品的碳源利用能力低下.

不同样点空气微生物的AWCD值大小顺序为YRBS>TJCR≈ZJGSUJC>BLQG，空气微生物群落功能多样性指数的大小顺序为YRBS>TJCR>ZJGSUJC>BLQG. 室外空气中微生物的浓度、 生理活性及碳源利用能力与车流量、 人员流动及植被覆盖密切相关，车流量和人员流动较多的环境微生物浓度和活性较高，而植物挥发性分泌物对空气中的细菌具有灭杀作用[11, 26, 27]. YRBS人员流动非常多，车流量较多，而基本没有植被覆盖，这些环境条件使得YRBS空气细菌浓度及活性最高； TJCR车流量非常多，人员流动一般，有极少量植被覆盖，ZJGSUJC学生流动较多，车流量较小，有约50%的植被覆盖率，因此，TJCR和ZJGSUJC空气细菌浓度和活性较高； 而BLQG人员流动较少，没有车流量，并且植被覆盖率达到95%及以上，是个相对洁净的环境，缺少细菌气溶胶粘附的载体，不利于空气细菌的繁殖和生长，同时，大面积的绿地和不同种类的植物对空气细菌也有滤除作用，这些环境条件使得BLQG空气细菌的浓度和活性在4个样点中最低.

TJCR与ZJGSUJC两个样点空气微生物群落相近，碳代谢功能无显著差异，而YRBS、 BLQG和TJCR空气微生物群落差异较大，碳代谢功能差异显著. TJCR是交通干线，ZJGSUJC是文教区，空气中微生物浓度增加的主要原因均是由于人类活动引起的地面扰动，使得近地面的灰尘粒子浓度增加，从而导致空气中微生物数量增加，两者空气微生物的来源基本相同，因此空气微生物的群落结构，对碳源的利用特征基本相似； YRBS是商业区，空气微生物浓度增加的主要原因一方面是人类活动引起的近地面灰尘粒子浓度增加，另一方面是由于人员流量非常大，人们在喷嚏、 咳嗽、 说话时有口、 鼻喷出的飞沫，附于飞沫中的细菌及人们皮肤和头发表面微生物的释放也是其空气微生物的来源，因此YRBS与TJCR、 ZJGSUJC空气中微生物的群落结构不相同； BLQG是旅游风景区，平时人员流量较小，其空气微生物浓度较低的主要原因是较高的植被覆盖率使得空气中的充满着植物挥发性分泌物，而植物挥发性分泌物具有灭杀细菌的作用，因此部分细菌被灭杀而导致空气中微生物群落结构与YRBS、 TJCR不相同[27].

4 结论

(1)YRBS空气中微生物群落的碳代谢能力最强，主要表现为具有较高的AWCD值和功能多样性指数，其次为TJCR和ZJGSUJC，空气中微生物碳代谢能力最弱是BLQG.

(2)不同样点空气中微生物群落对糖类和氨基酸类碳源的利用率明显高于羧酸类、 聚合物类、 胺类以及其它类型的碳源.

(3)空气中微生物代谢基质主成分1贡献度为43.8%，主成分2为23.4%，主成分1荷载0.55以上基质有51种，主成分2只有11种，从碳代谢特征来看，TJCR与ZJGSUJC空气微生物群结构基本相似，而YRBS、 BLQY、 TJCR空气微生物群落特征完全不同.

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