环境科学  2014, Vol.35 Issue (2): 740-745   PDF    
引用本文
周娜娜, 柏耀辉, 梁金松, 罗金明, 刘锐平, 胡承志, 袁林江. Pseudomonas sp. QJX-1的锰氧化特性研究[J]. 环境科学, 2014, (2): 740-745.  
ZHOU Na-na, BAI Yao-hui, LIANG Jin-song, LUO Jin-ming, LIU Rui-ping, HU Cheng-zhi, YUAN Lin-jiang. Characterization of Manganese Oxidation by Pseudomonas sp. QJX-1[J]. Environmental Science, 2014, (2): 740-745.  
Pseudomonas sp. QJX-1的锰氧化特性研究
周娜娜1,2, 柏耀辉2, 梁金松2, 罗金明2, 刘锐平2, 胡承志2, 袁林江1    
1. 西安建筑科技大学环境与市政工程学院, 西安 710055;
2. 中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室, 北京 100085
收稿日期: 2013-6-7; 修订日期: 2013-7-22.
基金项目： 国家自然科学基金项目（41171377）；中国科学院知识创新工程重要项目（KZCX2-EW-410）
作者简介：周娜娜(1988~),女,硕士研究生,主要研究方向为生物锰氧化物的生成及应用,E-mail:zhounana1020@163.com
通讯联系人,E-mail:yhbai@rcees.ac.cn
摘要：从锰矿土壤样品中分离、纯化出1株高效锰氧化细菌（QJX-1），经16S rDNA序列鉴定为Pseudomonas sp. QJX-1. 研究表明，Pseudomonas sp. QJX-1含有锰氧化的必需成分多铜氧化酶基因CumA，当初始Mn2+为5.05 mg·L-1，菌密度D600为0.020时，该菌可在48 h内将Mn2+转化，且转化率高达99.4%. 在寡营养条件下该菌锰氧化速率较富营养条件下有显著提高；添加石英砂滤料促使生物膜的快速形成，进而促进Mn2+的生物转化. 根据研究结果推测地下水处理过程中生物锰氧化速率较快.
关键词： Pseudomonas sp. QJX-1     生物锰氧化     寡营养     石英砂     生物膜    
Characterization of Manganese Oxidation by Pseudomonas sp. QJX-1
ZHOU Na-na1,2, BAI Yao-hui2, LIANG Jin-song2, LUO Jin-ming2, LIU Rui-ping2, HU Cheng-zhi2, YUAN Lin-jiang1    
1. School of Environmental and Municipal Engineering, Xi'an University of Architecture and Technology, Xi'an 710055, China;
2. State Key Laboratory of Environmental Aquatic Chemistry, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
Abstract: A manganese-oxidizing bacteria (QJX-1) was isolated from the soil of a manganese mine. It was identified as Pseudomonas sp. QJX-1 by 16S rDNA sequencing. Experimental results showed that the Pseudomonas sp. QJX-1 has a multi-copper oxidase gene CumA, which is an essential component for manganese oxidation by Pseudomonas sp. Under the condition of low initial inoculum level (D600, 0.020), 5.05 mg·L-1 Mn2+ could be oxidized by QJX-1 within 48 h with a conversion rate of as high as 99.4%. In comparison with the eutrophic conditions, the oligotrophic condition dramatically increased the biological manganese oxidation rate. Biofilm formation by employing the quartz sand could further improve the oxidation rate of Mn2+. Based on these results, it is speculated that biological manganese oxidation in underground water treatment is comparatively high.
Key words: Pseudomonas sp. QJX-1     biological manganese oxidation     oligotrophic     quartz sand     biofilm    

锰(Mn)是地壳中含量第十的元素，也是人体必需的微量元素之一. 而作为饮用水主要来源的地下水中常含有过量的锰，但是长期摄入过量锰会对人体造成危害[1]. 鉴于高浓度含锰水的危害性，从保障饮用水卫生、 安全，提高生活质量出发，研究饮用水除锰技术是必要的. 地下水中的锰主要以可溶性的Mn2+形式存在； Diem等[2]的研究表明，在仅有O2存在而没有锰氧化菌或者某些特殊矿物存在时，Mn2+很难被氧化. 同时相关研究表明，Mn2+的生物锰氧化速率比化学氧化高几个数量级[3]，故Mn2+的生物氧化在地下水环境中起着至关重要的作用[4, 5, 6]. 自然界中的锰氧化菌分布十分广泛，包括许多细菌、 真菌、 藻类和一些真核细胞[7]. 锰氧化菌可以利用酶促反应催化氧化Mn2+，生成不溶于水的Mn4+锰氧化物[8, 9, 10]； 而生成的生物氧化锰具有高的催化氧化能力和比表面积，进而通过吸附氧化作用去除水体其它污染物.

目前研究最多的锰氧化菌主要包括3种模式菌：分别是生盘纤发菌SS-1(Leptothrix discophora)，它是鞘状结构的淡水异养菌株，产生的锰氧化物沉积在胞外菌鞘[11, 12]； 芽胞杆菌SG-1(Bacillus)，从海边含锰的沉积物中分离出来，主要通过产生的芽胞来氧化Mn2+[10, 13, 14]； 假单胞菌MnB1和GB-1(Pseudomonas putida)，它们在淡水和土壤环境中普遍存在，并在细胞表面形成生物氧化锰[15, 16, 17]. 从20世纪60年代起，研究人员陆续对假单胞菌氧化锰进行了相关研究[18]. Francis等[9]和Tebo等[19]对假单胞菌的氧化机制进行了研究，发现锰氧化过程与多铜氧化酶CumA有关. Okazaki等[20]对假单胞菌氧化锰的基本性质进行了研究，发现NaN3、 KCN、 EDTA、 Tris或邻二氮杂菲(o-phenanthroline)会抑制假单胞菌的氧化活性. De Vrind等[21]研究了恶臭假单胞菌GB-1中细胞色素c参与锰氧化的机制.

本研究从锰矿土壤样品中分离出高效的锰氧化菌Pseudomonas sp. QJX-1，分析该菌生物锰氧化的过程与机制，探讨其在寡营养水体和添加石英砂滤料的培养基中的锰氧化效率，以期为地下水的锰氧化机理探讨及该菌株的工程应用研究提供支持.

1 材料与方法
1.1 培养基

细菌的富集培养采用PYG[22]培养基(peptone-yeast extract-glucose)，PYG成分：蛋白胨、 葡萄糖、 酵母膏各0.25 g ·L-1，8 mg ·L-1的CaCl2 ·2H2 O，0.5 g ·L-1的MgSO4 ·7H2 O； pH值为7.0~7.5，采用缓冲液终浓度为10~20 mmol ·L-1的HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid，4-羟乙基哌嗪乙磺酸)调节.

1.2 细菌的分离、 纯化与鉴定

取2 g湖南湘潭锰矿区域的土壤，加到高温灭菌(115℃，25 min)稀释为100倍的PYG培养基中，并加入5 mg ·L-1(100 μmol ·L-1)的MnCl2，其中MnCl2溶液和HEPES缓冲液均采用0.22 μm滤膜过滤灭菌，在30℃，170 r ·min-1的摇床中驯化培养. 每次培养7 d后，取5 mL的菌液添加到新制备的45 mL PYG培养基中继续驯化，共驯化培养4次. 驯化结束后，利用涂布分离及平板划线法分离纯化锰氧化菌株，将分离的纯菌株保存在-70℃冰箱中备用.

菌种鉴定采用16S rDNA序列比对法，即以TIANGEN基因组DNA试剂盒提取该菌株的基因组DNA，作为PCR反应的模板，利用16S rDNA的通用引物27F和1492R进行PCR片断基因扩增[23]. PCR产物经纯化回收后送至上海美吉生物公司测序. 将测得的16S rDNA测序结果导入NCBI中的GenBank数据库中进行同源性比对.

1.3 细菌生物锰氧化过程与机制
1.3.1 细菌生物锰氧化过程

取4℃冰箱中Pseudomonas sp. QJX-1的菌液进行活化； 将其接种到装有100 mL不含Mn2+的PYG培养基中，30℃，170 r ·min-1振荡培养48 h.

取10 mL上述活化后的菌液，加入到250 mL的三角瓶中，并加入90 mL的新鲜PYG培养基，将HEPES缓冲液和Mn2+母液一起用高温灭菌的0.22 μm滤膜过滤后添加到培养基中，使得HEPES的终浓度为10 mmol ·L-1，Mn2+终浓度为5 mg ·L-1(100 μmol ·L-1)，30℃，170 r ·min-1振荡培养72 h. 在培养过程中，间隔特定时间取样测定其菌密度(D600)及Mn2+浓度； 在相同条件下，以不添加菌的培养基作为对照，试验设3组重复.

1.3.2 细菌生物锰氧化的机制

采用对多铜氧化酶基因CumA的扩增和锰氧化物的X射线晶体衍射(XRD)分析，研究潜在的锰氧化机制. Pseudomonas sp. QJX-1的CumA扩增方法参照文献[23]，以总DNA为模板进行PCR扩增. 引物[9]为：CumAIdg2B，5′-GAYGCCGGYAGCTAC TGGTAYCACCC- 3′； CumAIdgR，5′-ACYTTGAARS YCATGCCRTGCARRTG- 3′.

PCR反应程序为：94℃预变性3 min； 94℃变性30 s，45℃退火30 s，60℃延伸1 min，共30个循环，最后72℃延伸2 min，4℃保存. 将PCR产物送至上海美吉生物公司测序，测得的16S rDNA测序结果导入NCBI中的GenBank数据库中进行同源性比对.

XRD步骤：将Pseudomonas sp. QJX-1接种到含5 mg ·L-1 Mn2+的PYG培养基中，培养一周后，取500 mL锰氧化物的混合液离心分离(12000 r ·min-1，5 min)并用去离子水清洗3次，将得到的生物氧化锰样品在-40℃冷冻干燥72 h后； 采用电流为20 mA，扫描范围10°~80°，扫描速度为2(°) ·min-1，对样品进行XRD(PAN X＇Pert PRO，荷兰)图谱分析.

1.4 营养条件对Pseudomonas sp. QJX-1锰氧化的影响

采用PYG液体培养基作为富营养培养基，稀释50倍的PYG作为寡营养培养基； 将Pseudomonas sp. QJX-1接种到250 mL的三角瓶中，再加入90 mL含Mn2+的新鲜PYG液体培养基(同1.3.1节)，室温静置培养9 d. 在培养过程中，间隔特定时间取样测定其Mn2+浓度； 试验设不加菌的空白对照及3组重复.

1.5 石英砂滤料对寡营养条件下Pseudomonas sp. QJX-1锰氧化的影响

在250 mL的三角瓶中加入2 cm厚度的粒径大小为0.8~1.0 mm的石英砂，加入150 mL的寡营养培养基，将Pseudomonas sp. QJX-1接种到含5 mg ·L-1 Mn2+的培养基中(同1.3.1节)，室温静置培养3 d，间隔特定时间取样测定其Mn2+浓度. 然后每隔3 d采用相同含Mn2+的寡营养培养基替换原有的培养基，室温静置培养3 d，间隔特定时间取样测定其Mn2+浓度. 在相同条件下，以不添加石英砂滤料的培养基作为对照，试验设3组重复，实验结束后，取石英砂滤料用SEM做形态观察.

1.6 分析方法

Mn2+浓度：培养液样品经0.22 μm滤膜过滤后，通过电感耦合等离子体原子发射光谱法 (700 series ICP-OES)测定Mn2+的浓度.

菌密度(D600)：用紫外-可见光分光光度计(U-3010)，在波长为600 nm处检测菌液吸光度.

2 结果与讨论
2.1 Pseudomonas sp. QJX-1的分离、 纯化与鉴定

通过驯化，分离及纯化获得1株能在固体培养基下高效转化Mn2+的菌株QJX-1； 将其16S rDNA基因导入到NCBI中的GenBank中进行同源性比对，结果表明，最大相似菌株为假单胞菌(Pseudomonas putida，JF825523)，相似度为99%. 综合QJX-1的菌体形态特征和生理生化特征，确定该菌株属于假单胞菌，并命名为Pseudomonas sp. QJX-1，系统发育树见图 1.

图 1Pseudomonas sp. QJX-1的16S rDNA序列系统发育树Fig.1Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of strain Pseudomonas sp. QJX-1

Pseudomonas sp. QJX-1为革兰氏阴性好氧无芽胞菌，呈杆状或略弯，长为1~2.1 μm，宽为0.5~0.9 μm，细胞两端圆钝. 锰氧化最适温度为30℃，最佳pH值为7.5. Okazaki等[20]对Pseudomonas fluorescens GB-1的研究表明，锰氧化活性出现在生长曲线的稳定期初期，最适pH和温度分别为7.0和35℃，其锰氧化过程最佳条件与本试验结果相近. 说明假单胞菌适合在中性和偏高于常温的条件下进行锰氧化.

2.2 Pseudomonas sp. QJX-1生物锰氧化的过程与机制
2.2.1 锰氧化过程

由图 2可以看出，空白试验中锰含量没有明显变化，说明Mn2+的转化是Pseudomonas sp. QJX-1作用的结果. 菌Pseudomonas sp. QJX-1在PYG培养基中生长，D600值在10 h内从0.020±0.02升高到0.268±0.03，经历了10 h的对数生长期，60 h的稳定期； 随着Pseudomonas sp. QJX-1的生长，培养基中Mn2+的含量逐渐降低，24 h之前Mn2+转化率较低，此时菌体适应培养基需要一个过程，之后菌体生长旺盛，对Mn2+的吸附和氧化作用增强，在48 h后将(5.05±0.06)mg ·L-1的Mn2+转化，且转化率高达99.4%，溶液中Mn2+的终浓度为(0.03±0.01)mg ·L-1.

图 2Pseudomonas sp. QJX-1生长曲线及对Mn2+的转化Fig.2Growth curve and Mn2+ oxidation of Pseudomonas sp. QJX-1
2.2.2 锰氧化机制

近年来许多学者用分子生物学方法对锰氧化菌进行了研究，发现许多基因参与锰氧化过程中，比如MnxG、 CumA、 mofA、 与细胞色素C、 醌类有关的基因等[24]. 由图 3可以看出，本试验用CumA的简并引物扩增出一段800 bp的基因. 该基因与Francis等[9]报道的Pseudomonas sp. ISO6(AF326402)的CumA有99%的氨基酸同源性. 研究表明，CumA被认为是假单胞菌锰氧化活性的必需成分[25, 26]，因为编码多铜氧化酶的基因受损时，其锰氧化活性会失去，因此CumA在假单胞菌锰氧化过程中是必不可少的基因.

图 3CumA的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图Fig.3Agarose gel electrophoresis of PCR product of CumA

图 4为生物氧化锰的XRD图谱，从中可以看出，生物氧化锰无明显的峰，只有个别的馒头峰，表明菌Pseudomonas sp. QJX-1氧化生成的氧化锰是无定形态或短程有序的物质. 这与以往研究结果类似，如Villalobos等[16]发现Pseudomonas putida MnB1形成的生物氧化锰是弱结晶的层状结构； Kim等[27]的研究也表明，生物氧化锰一般是结晶弱或短程有序的纳米级矿物，具有较高的比表面积和反应活性.

图 4生物氧化锰的XRD图谱Fig.4XRD patterns of biogenic Mn oxides
2.3 营养条件对Pseudomonas sp. QJX-1锰氧化的影响

为更接近模拟地下水中的缺氧状态，本试验采用静置培养. 由图 5可以看出，当初始Mn2+为5 mg ·L-1，D600为0.020，静置培养9 d时，富营养培养基中Mn2+的含量没有变化，一直保持在5 mg ·L-1左右； 而在寡营养培养基中，经过4.5 d后Mn2+的含量从(5.20±0.16)mg ·L-1降到(4.06±0.03)mg ·L-1，转化率为21.92%. 说明Pseudomonas sp. QJX-1在寡营养条件下的锰氧化效果较富营养条件下好. 类似研究表明[28]，锰氧化细菌属贫营养微生物，这种微生物比表面积很大、 比增长速率很小、 内源呼吸速率常数(b)较低、 饱和常数(KS)较小，其在寡营养中生长良好.

图 5Pseudomonas sp. QJX-1在不同营养条件下的锰氧化Fig.5Mn Oxidation by Pseudomonas sp. QJX-1 under different nutritional conditions
2.4 石英砂滤料对寡营养条件下Pseudomonas sp. QJX-1锰氧化的影响

选用石英砂作为滤料，因为石英砂取材容易，且在饮用水水厂运行中具有成熟的经验. 由图 6可以看出，寡营养条件下，当初始Mn2+为5 mg ·L-1，D600为0.020，静置培养时，Pseudomonas sp. QJX-1在不含有石英砂滤料的培养基中氧化速率缓慢，在12 d中Mn2+从5.28 mg ·L-1降到4.14 mg ·L-1，去除率仅为21.47%； 相比之下，含石英砂滤料的Pseudomonas sp. QJX-1在3 d就将Mn2+彻底氧化. 在第一次换取寡营养培养基的条件下，且继续投加相同浓度的Mn2+，试验发现Mn2+从(4.43±0.32)mg ·L-1降到(1.27±0.20)mg ·L-1，Mn2+的去除率也高达71.27%； 第二次换取培养基并且继续投加相同浓度的Mn2+，Mn2+从(4.61±0.21)mg ·L-1降到(3.10±0.22)mg ·L-1，Mn2+的去除率为32.81%； 第三次换取后，Mn2+的去除率仍为26.28%，与不加石英砂滤料的培养基在12 d中的去除率相比也高出4.81%. 说明添加滤料的培养基对Pseudomonas sp. QJX-1去除Mn2+有明显的促进作用. 随着Pseudomonas sp. QJX-1的生长，其在石英砂表面形成一层生物膜. Ahmad等[29]研究表明，由于细菌为疏水性胶体，可以牢固地通过水合作用力黏附在滤料上，且在静置时不易从滤料表面脱落. 锰氧化细菌为提高在寡营养环境中存活潜能，细菌细胞和锰氧化物形成丝状体，并且附着于石英砂表面伸展，使细胞能最大限度地相互依赖，且在更大的范围内共享营养，以最小的代价维持生存和稳定，形成生物膜； 其比表面积很大，内源呼吸速率常数较低； 所以生物膜的形成能促进对Mn2+的氧化与吸附.

图 6 Pseudomonas sp.QJX-1与石英砂滤料结合对Mn2+的氧化Fig.6Oxidation of Mn2+ by Pseudomonas sp. QJX-1 combined with quartz sand filter

研究表明，锰氧化细菌在去除饮用水中锰的同时，生成的锰氧化物对多种重金属离子有很高的吸附能力和很强的氧化能力[30, 31, 32, 33, 34]，如Ni、 Cr、 Co、 Pb、 U和Zn； 还对环境中难降解物质和新型污染物有氧化作用[35, 36, 37, 38, 39]，如腐殖质、 环境激素[17α-炔雌醇(EE2)]、 类固醇雌性激素、 灭草剂(草甘膦、 氨甲基膦酸盐)、 抗生素及药物. 因此，锰氧化物可以控制重金属离子和有机物在环境中的迁移转化，进而在水处理中发挥作用. 对于Pseudomonas sp. QJX-1锰氧化的研究不仅有助于认识自然界重金属离子和有机物形态的转化和迁移规律，同时有助于挖掘Pseudomonas sp. QJX-1的工程应用潜力.

3 结论

(1)从锰矿土壤样品中分离纯化到1株高效锰氧化细菌QJX-1，经16S rDNA序列鉴定为假单胞菌，故命名为Pseudomonas sp. QJX-1. 且锰氧化最适温度为30℃，最佳pH值为7.5.

(2)Pseudomonas sp. QJX-1含有锰氧化过程中的必需成分多铜氧化酶基因CumA. 当Mn2+为5 mg ·L-1，D600为0.020，30℃，170 r ·min-1培养3 d时，该菌在48 h时内将Mn2+转化，转化率为99.4%.

(3)Pseudomonas sp. QJX-1在贫营养条件下能更好地进行锰氧化，且在石英砂表面形成的生物膜促进了Mn2+的氧化和吸附. 当Mn2+为5 mg ·L-1，D600为0.020，静置培养时，去除率高达99.9%； 培养基经过3次换取后，去除率分别为71.27%、 32.81%、 26.28%； 且其都明显高于不加石英砂滤料的培养基. 试验结果表明地下水处理过程中生物锰氧化速率较快； 同时Pseudomonas sp. QJX-1具有应用于水处理工程的潜力.

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