环境科学  2014, Vol.35 Issue (2): 520-525   PDF    
引用本文
何觉聪, 黄倩茹, 陈洲洋, 叶杞宏, 罗雨薇, 魏在山*. 生物滴滤塔处理苯酚气体研究[J]. 环境科学, 2014, (2): 520-525.  
HE Jue-cong, HUANG Qian-ru, CHEN Zhou-yang, YE Qi-hong, LUO Yu-wei, WEI Zai-shan. Gaseous Phenol Removal in a Bio-Trickling Filter[J]. Environmental Science, 2014, (2): 520-525.  
生物滴滤塔处理苯酚气体研究
何觉聪, 黄倩茹, 陈洲洋, 叶杞宏, 罗雨薇, 魏在山    
中山大学环境科学与工程学院, 广东省环境污染控制与修复技术重点实验室, 广州 510275
收稿日期: 2013-3-11; 修订日期: 2013-5-6.
基金项目： 广东省科技计划项目（2011A030700010）；广州开发区科技计划重点科技攻关计划项目（2010Q-P161）；企业委托项目（7102651，7101614）
作者简介：何觉聪(1989~),男,硕士研究生,主要研究方向为废气生物处理,E-mail:anniedam@126.com
通讯联系人,E-mail:wzs89@126.com
摘要：采用生物滴滤塔处理苯酚气体，考察了苯酚去除性能的影响因素. 结果表明，生物滴滤塔能高效处理苯酚气体，苯酚去除效率可达99.5%，长期运行平均去除效率在98%左右. 适宜的运行条件为：停留时间20.6 s，循环液pH值7.0，喷淋密度1.67 m3·（m2·h）-1. 采用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）技术研究处理苯酚气体的生物滴滤塔填料表面的微生物，结果表明，生物滴滤塔内有5种降解苯酚的优势菌种：Polaromonas sp.、Acinetobacter sp.、Acidovorax sp.、Veillonella parvula和Corynebacterium sp.. 采用GC-MS分析出口气样，结果表明丙酮酸（CH3COCOOH）为生物降解苯酚的中间产物，并推测了苯酚生物降解的可能途径.
关键词： 苯酚     生物滴滤塔     PCR-DGGE     GC-MS     机制    
Gaseous Phenol Removal in a Bio-Trickling Filter
HE Jue-cong, HUANG Qian-ru, CHEN Zhou-yang, YE Qi-hong, LUO Yu-wei, WEI Zai-shan    
Guangdong Provincial Key Laboratory of Environmental Pollution Control and Remediation Technology, School of Environmental Science and Engineering, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China
Abstract: The performance of a bio-trickling filter (BTF) for treatment of phenol, a model pollutant, was presented. Influences of factors on phenol removal efficiency were studied. The BTF exhibited a high removal efficiency for phenol. The experimental results showed that the phenol efficiency reached 99.5% and kept 98% in the long-term run. The optimal residence time, pH value and spray density were 20.6 s, 7.0 and 1.67 m3·(m2·h)-1, respectively. The microbial community structures in the bio-trickling filter for phenol removal were assessed by PCR-DGGE.Based on the 16S rDNA sequence data,results showed that the predominant bacteria for degradation of phenol were Polaromonas sp., Acinetobacter sp., Acidovorax sp., Veillonella parvula and Corynebacterium sp.. GC-MS was used to detect component of BTF's outlet gases and pyruvic acid(CH3COCOOH) was found as one kind of intermediates of phenol degradation. Then one possible biodegradation pathway of phenol was inferred.
Key words: phenol     bio-trickling filter (BTF)     PCR-DGGE     GC-MS     mechanism    

苯酚是一种酚类挥发性有机物，主要来源于炼钢、 聚合树脂生产、 陶瓷生产、 污泥焚烧/烘干等过程，并随污水和废气而排放到环境中[1， 2]. 苯酚常温下微溶于水，有特殊的臭味，还具有强烈的腐蚀性和毒性，成年人如摄取1~32 g的苯酚可致死. 苯酚既可通过人的肺部吸收，也由于其低挥发性和对水的强亲和力，使得人饮用被苯酚污染的水而危害健康[3]. 因此，苯酚被列入《环境优先控制有毒有机污染物》的名单[4]．

苯酚的传统处理方法是物理-化学法，但其缺点是运行费用高、 产生有毒中间产物以及不完全矿化[2，5]. 生物法由于具有投资及运行费用低、 无二次污染、 易于管理操作等优点[6， 7]，逐渐被运用于处理苯酚污染的土壤、 水和空气中. 国外用聚合物微球异地生物修复被苯酚污染的土壤，成功将土壤中苯酚的浓度由2.3g ·kg-1降到100 mg ·kg-1 [8]； 采用布朗纤维藻和四尾栅藻处理橄榄油厂的苯酚废水，苯酚的去除效率大于70%[9]. 国内用好氧颗粒污泥净化苯酚废气，苯酚去除率达到95%以上[10]； 用生物洗涤法治理含苯酚废气，消除负荷为30 g ·(m3 ·h)-1左右[11]. 与生物洗涤法相比，生物滴滤法填料能提供更大的传质面积和较好的微生物生长环境，更适合于处理微溶(如苯酚)或难溶于水的气体. 生物滴滤法处理甲苯、 二甲苯、 苯乙烯等挥发性有机物已有大量研究[12, 13, 14]，但是利用生物滴滤法处理苯酚气体的研究鲜见报道. 本研究采用生物滴滤塔对苯酚废气进行处理，考察各影响因素对苯酚净化效率的影响，推测苯酚生物降解的机制，采用PCR-DGGE技术分析处理苯酚气体的生物滴滤塔中细菌的16S rDNA基因信息和多样性，以确定其中的优势菌群，以期为苯酚废气生物处理的高效稳定运行提供科学依据.

1 材料与方法
1.1 实验装置与方法

生物滴滤塔处理苯酚废气的实验流程如图 1所示. 生物滴滤塔为有机玻璃柱，内径为90 mm，总高度为1000 mm，分为3层，每层装有填料150 mm，填料总高度为450 mm. 填料为轻质陶粒，陶粒的比表面积为3900 m2 ·m-3，孔隙率58%，堆积密度为0.36～0.8g ·cm-3，真密度为1.2～1.6g ·cm-3. 苯酚气体采用动态法配制，苯酚与压缩空气一起进入缓冲瓶混合，使苯酚浓度均匀，经流量计调节流量后从塔底进入生物滴滤塔，在上升的过程中与循环液及陶粒表面的生物膜接触，苯酚首先被循环液及生物膜吸附，然后进入微生物细胞被降解，净化后的气体从塔顶排出. 循环液体从塔顶向下喷淋，在填料层中自上向下流动，由塔底排出至循环液槽，再由循环水泵抽回塔顶. 定期向循环液储槽投加氮磷营养液并设曝气头进行曝气，以维持微生物的好氧生长繁殖活动. 实验所用微生物取自某生活污水处理厂，经使用苯酚驯化后直接加进循环液槽中，通过喷淋在陶粒上挂膜培养.

图 1 生物滴滤塔处理苯酚气体实验流程示意 Fig. 1 Schematic diagram of the bio-trickling filter (BTF) for phenol removal
1.2 分析方法 苯酚气体浓度采用美国RAE Systems的PGM-7300 型挥发性有机物(VOCs)检测仪测定； 气体流量用LZB型玻璃转子流量计测定，测量范围为0.1~1.0 m3 ·h-1. 循环液pH值采用上海三信仪表厂的pHB-3型笔式pH计测定.

气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)分析方法：对生物滴滤塔出口气体的处理采用固体吸附-萃取解吸的方法. 采用活性炭作为吸附剂，采样流量为1.0 L ·min-1，采样时间为30 min. 采样完毕后使用CS2作为萃取剂，对活性炭吸附的有机气体进行萃取解吸，萃取液为待测样品. 色谱柱为石英毛细管柱，初始柱温为40℃，保持5 min后以10℃ ·min-1升至250℃，保持5 min. 载气为高纯氦气，柱流量为1.0 mL ·min-1，玻璃注射器为1 μL，进样量为0.2 μL，流比为20 ∶1. 色谱-质谱接口温度230℃； EI源，电子能量：70 eV； 离子源温度220℃； 全扫描(Scan)方式定性.

PCR-DGGE分析方法：首先提取样品的DNA，以提取到的DNA作为PCR 模板，所用引物为细菌16S rDNA V3高变区F338 和R534，反应程序为：94℃ 5 min 预变性； 20 cycles (94℃ 40 s； 65℃ 30 s； 72℃ 30 s)； 15 cycles(94℃ 40 s； 55℃ 30 s； 72℃ 30 s)； 72℃延伸10 min. 接着采用 D-Code 突变检测系统对样品进行DGGE 分析. 所用的聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，变性剂浓度从40%～65%. 在70 V电压下， 60℃恒温， 1×TAE 中电泳13 h. 电泳完毕后，用超纯水冲洗胶，然后将胶放进含5% Goldview 的染液中，置于摇床上染色30 min后，凝胶成像系统拍摄图谱. 最后将DGGE电泳条带的切胶回收、 V3 区再扩增及测序.

2 结果与讨论
2.1 生物滴滤塔长期运行稳定性

在进气苯酚浓度为20~400 mg ·m-3，循环液pH值为6.5~7.2，喷淋密度为1~2 m3 ·(m2 ·h)-1，气体流量为0.5 m3 ·h-1的条件下，生物滴滤塔处理苯酚的长期运行情况如图 2所示. 在长达77 d的运行时间内，生物滴滤塔表现出良好的稳定性以及对苯酚的高效去除率. 挂膜第1 d，生物滴滤塔对苯酚的去除效率为61.0%，由于开始挂膜，生物膜未在陶粒上形成，此时苯酚的部分溶解和陶粒对苯酚分子的吸附起主要作用. 第2~7 d，去除效率不断增大并达到96.3%，同时可观察到陶粒表面逐渐形成生物膜； 第8~11 d，苯酚的去除效率上下有些浮动，但基本保持在96%左右. 第13 d，陶粒表面可看到有明显的生物膜，同时向循环液槽中添加N、 P营养物质，第15 d效率提高到99.4%. 第16~33 d，苯酚浓度在80~290 mg ·m-3范围内缓慢变化，去除效率可维持在97%以上，此时可认为系统已挂膜完成，填料塔内形成较厚的生物膜，表现出对苯酚的高效去除效率. 第35~37 d，以较快的速度将苯酚浓度从100.3 mg ·m-3增大到403.1 mg ·m-3，效率下降到90.2%，但降低苯酚浓度后，去除效率逐渐恢复到98.1%，第46~51 d重复此操作，得到相似结果，说明生物滴滤塔对于苯酚浓度的较大变化具有良好的稳定性. 第61~62 d，系统停止通入气体，只保持循环液喷淋，于第63 d恢复正常通气，此时苯酚的去除效率为92.5%，并逐渐恢复到原来水平，采用生物滴滤塔处理苯酚废气能较好地适应实际工业的间歇生产.

图 2 生物滴滤塔长时间运行曲线Fig. 2 Long-term run curves of the BTF

图 3 苯酚浓度对去除效率的影响曲线 Fig. 3 Influence of phenol concentration on its removal efficiency
2.2 苯酚浓度对去除效率的影响 在气体流量为0.5 m3 ·h-1,循环液pH值为7.0，喷淋密度为1.67 m3 ·(m2 ·h)-1的条件下，苯酚去除效率随苯酚浓度的变化如图 3所示. 苯酚浓度小于200 mg ·m-3时，随苯酚浓度的增大，去除效率变化较小，当苯酚浓度为200 mg ·m-3时，去除效率仍达到98.0%. 但苯酚浓度超过200 mg ·m-3时，去除效率下降较快，苯酚浓度增大到359 mg ·m-3时，去除效率降低到91.3%. 但苯酚的去除量随着进口浓度的增加而逐渐增加，由15.8 g · (m3 ·h)-1增加到57.3 g · (m3 ·h)-1. 根据“吸附-生物膜”理论可知，苯酚通过气膜扩散到湿润的生物膜表面进而被微生物所捕获降解[15]，对于低浓度的苯酚废气，填料塔内的生物膜表面所吸附的苯酚分子仍处于不饱和状态，其生化去除量随着进口浓度的增加而增大，两者间基本呈线性关系，这与图 3的实验结果相吻合，此时苯酚的降解反应为宏观动力学一级反应，苯酚的去除速率随苯酚浓度增加而增大[16].
2.3 停留时间对去除效率的影响 在苯酚浓度为200 mg ·m-3,循环液pH值为7.0，喷淋密度为1.67 m3 ·(m2 ·h)-1的条件下，苯酚去除效率随停留时间的变化如图 4所示. 从中可知，随着气体停留时间的增大，苯酚去除效率呈现先增大后平稳的过程. 气体流量较小时，气体在滴滤塔中的停留时间长，苯酚气体与生物膜接触较充分，易被生物膜吸附、 降解，因而去除率较高； 增大气体流量，流速增加，气体湍流程度增强，会影响苯酚气体在生物膜表面吸收吸附以及生化降解，同时气体在滴滤塔内的停留时间缩短，部分苯酚污染物来不及降解就排出塔外，导致去除效率降低. 在本实验研究范围内，较适宜的停留时间为20.6 s，此时苯酚去除效率达到98.0%.
图 4 停留时间对去除效率的影响曲线 Fig.4 Influence of residence time on phenol removal efficiency
2.4 循环液pH值对去除效率的影响 在苯酚浓度为200 mg ·m-3,气体流量为0.5 m3 ·h-1，喷淋密度为1.67 m3 ·(m2 ·h)-1的条件下，苯酚去除效率随循环液pH值的变化如图 5所示. 从中可知，当循环液pH值在4.5~8.5范围内变化时，苯酚的去除效率都在88%以上，说明生物滴滤塔在较宽的酸碱范围内对苯酚有较好的降解. 其中pH为7.0时，去除效率最高，说明苯酚在中性介质中降解效果最好[17]. 长期不人工调节循环液pH值时，循环液偏弱酸性，原因其一可能是部分苯酚溶于循环液中，苯酚是一种弱酸，可使循环液pH降低； 其二可能是苯酚在生物降解的过程中生成其它的酸性物质转移到液相. 循环液弱酸性对苯酚去除效率影响不大，因此可不用调节pH值.

图 5 循环液pH值对去除效率的影响曲线 Fig.5 Influence of pH value on phenol removal efficiency
2.5 喷淋密度对去除效率的影响 在苯酚浓度为200 mg ·m-3,气体流量为0.5 m3 ·h-1，循环液pH值为7.0条件下，苯酚去除效率随喷淋密度的变化如图 6所示. 随着喷淋密度由0.31 m3 ·(m2 ·h)-1增加到1.67 m3 ·(m2 ·h)-1，苯酚的去除效率相应从89.7%增大至98%，但继续增大喷淋密度，去除效率变化很小. 循环液的喷淋为微生物提供湿润的环境和补充正常生长代谢所需营养，同时带走老化脱落的生物膜，促进新生物膜的生成，维持整个系统的高效稳定[18]. 当喷淋密度较小时，填料表面不利于微生物生存，影响去除效果. Zhao等[19]提出，循环液的喷淋以达到湿为润生物膜的目的为宜. 苯酚微溶于水，室温下在水中溶解度为9.3 g，水吸收苯酚的能力是有限的，在一定范围内适当增大喷淋密度，能提高去除效率，但喷淋密度继续增大，对苯酚的去除效率没有明显的增加.
图 6 喷淋密度对去除效率的影响曲线Fig.6 Influence of spray density on phenol removal efficiency
2.6 生物SEM和PCR-DGGE结果分析 在生物滴滤塔运行稳定时期，从中取出陶粒，并经过戊二醛溶液固化、 磷酸缓冲液清洗、 酒精脱水、 叔丁醇置换和冷冻干燥等处理，采用扫描电镜的方法观察陶粒表面微生物的分布及其形态，观察结果如图 7所示. 从中可以清晰看出，在生物塔的陶粒表面覆盖着大量轮廓分明、 表面光滑的微生物，其中大部分为杆状，长度1~4 μm，也存在少量的球状和短棒状. 这些微生物是苯酚的高效降解菌，其在陶粒表面的大量存在，对苯酚的高效去除具有关键的作用.

图 7 SEM结果Fig.7 SEM image

图 8 不同菌株的DGGE图谱 Fig.8 DGGE pattern of different strains
采用PCR-DGGE技术对生物滴滤塔内微生物样品进行测定分析. 经过检测可得出5条明亮的条带1~5(如图 8)，然后将条带切胶回收，进行测序，得到每种菌群的16S rDNA序列，最后将得到的16S rDNA与GenBank中已知菌种的16S rDNA序列进行对比分析，确定菌群所代表的微生物菌属，得到的5种菌属分别属于Polaromonas sp.(极胞菌属)、 Acinetobacter sp.(不动杆菌属)、 Acidovorax sp.(食酸菌属)、 Veillonella parvula(小韦荣氏球菌)和Corynebacterium sp.(棒状杆菌属). 根据条带的明暗度分析该条带对应菌属的丰度，结果显示5种菌属的丰度依次分别为22.3%、 7.2%、 19.8%、 10.1%和40.6%. 根据5种菌种的基因序列与GenBank中已知菌种的16S rDNA序列，构建生成菌种的系统发育树，如图 9所示. 从中可以看出，测序序列1、 5分别与极胞菌属(Polaromona)和棒状杆菌属(Corynebacterium)具有很近的亲缘关系. 李华等[20]证实了Acinetobacter sp.具有很强的苯酚生物降解能力，Mattes等[21]研究表明Polaromonas sp.能够利用邻苯二酚作为生存所需的碳源. 以上优势菌群形态为杆状、 球状和棒状，与SEM观察所得结果相符.
图 9 降解苯酚优势菌种基于部分长度的16S rRNA 序列的系统发育树 Fig.9 Phylogenetic tree based on the 16S rRNA sequences from the dominant bacteria for degrading phenol
3 苯酚生物降解机制

采用生物滴滤塔处理苯酚气体，在系统稳定运行期采集出口气体样品，运用气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪分析，除苯酚、 二硫化碳外还可检测出丙酮酸(CH3COCOOH)，推测丙酮酸为苯酚生物降解的中间产物.

图 10 苯酚生物降解的可能降解途径 Fig. 10 Possible degradation process of biodegradation of phenol
目前，生物法处理有机废气的机理普遍采用荷兰学者Ottengraf 提出的“吸收-生物膜”理论[22]，但国内相关学者针对低浓度难溶于水或微溶于水的有机气体对该理论进行了修正和补充，提出了“吸附-生物膜”理论[23]. 根据“吸附-生物膜”理论要点[24]和GC-MS检测结果，结合国外的相关研究[25， 26]，推测出苯酚生物降解的可能途径如图 10所示. 苯酚气体首先扩散通过气膜并被吸附在生物膜表面，进而被微生物捕获吸收； 优势菌群间的协同作用使苯酚被转化为邻苯二酚，邻苯二酚作为Polaromonas sp.的碳源并被降解为粘康酸半醛、 2-酮-4-烯戊酸和4-羟基-2-酮戊酸，食酸菌属Acidovorax sp.继续将产生的酸性物质分解为分子量较小的丙酮酸，Veillonella parvula和Corynebacterium sp.能通过氧化性或发酵性代谢将丙酮酸最终矿化为无害物质(CO2和H2 O).
4 结论

(1)生物滴滤塔能高效处理苯酚废气，去除效率可达99.5%，长期运行平均去除效率在98%左右. 适宜的运行条件为：停留时间20.6 s，循环液pH值7.0，喷淋密度1.67 m3 ·(m2 ·h)-1.

(2)生物塔内陶粒表面覆盖着大量的微生物，形态多数为杆状，并伴有少量的球状和短棒状. 通过PRC-DGGE技术分析得出生物塔内存在5种降解苯酚的优势菌群，分别属于极胞菌属、 不动杆菌属、 食酸菌属、 小韦荣氏球菌和棒状杆菌属.

(3) 采用GC-MS检测出丙酮酸为生物滴滤塔处理苯酚的中间产物，推测苯酚生物降解途径为：苯酚气体首先被吸附在生物膜表面，然后优势菌群通过一系列的代谢作用将苯酚分解为无害物质CO2和H2 O.

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