2014, Vol. 35
面对化石能源消费量急剧增长带来的环境问题和化石能源日益枯竭所带来的能源短缺现状[1]，开发和利用可再生的清洁能源变得日益重要和紧迫. 其中利用自然界最丰富的生物资源纤维素转化醇类、 甲烷或者氢气等生物质能已成为能源和生态环境领域研究的热点[2, 3]. 纤维素因其特定的结构使得生物转化效率较低[4],目前纤维素的生物转化可分为单一菌种的转化和复合菌的转化[5]. 单一菌系虽然易于控制且可遗传操作，但因其较低的转化效率依然难以达到工业化运行的目的. 复合菌系虽然有着较高的转化效率，如沼气的产生[6]，但是因其复杂的种群结构而难以解析，且对整个体系的代谢途径和过程难以进行有效的控制. 为建立可控和可解析的复合菌体系, 文献[7, 8]构建了一个由5株细菌组成的高效稳定纤维素降解产乙醇的复合系，这为研究可控制的纤维素降解复合系提供一条思路. 本研究结合传统培养法和分子生态学技术，建立了一种筛选简单降解纤维素产甲烷复合菌系的方法，并分离到一个由4株菌构成的降解纤维素产甲烷的稳定菌系，以期为今后纤维素转化甲烷复合菌系的代谢控制和遗传改造提供了一个平台.
M培养液(1000 mL)由980 mL基本培养液、 10 mL痕量元素溶液和10 mL维生素溶液组成[9]. 基本培养液(1000 mL)： KH2PO4 0.4 g; K2HPO4 ·3H2 O 0.4 g; NH4Cl 1.0 g; MgCl2 ·6H2 O 0.1 g; Yeast extract 0.2 g; NaHCO3 6.0 g; Cysteine-HCl ·H2 O 0.5 g; Na2S ·9H2 O 0.25 g; Resazurin 0.001 g. 痕量元素溶液(1 000 mL)： Nitrilotrialetic acid 4.5 g; FeCl2 ·4H2 O 0.4 g; CoCl2 ·6H2 O 0.12 g; AlK(SO4)2 0.01 g; NaCl 1.0 g; CaCl2 0.02 g; NaMoO4 ·2H2 O 0.01 g; MnCl2 ·4H2 O 0.1 g; ZnCl2 0.1 g; H3BO3 0.01 g; CuSO4 ·5H2 O 0.01 g; NiCl2 0.02 g. 维生素溶液(1 000 mL)： biotin 2.0 mg; Folic acid 2.0 mg; Pyridoxine hydrochloride 10 mg; Thiamine HCl 5.0 mg; Riboflavin 5.0 mg; Nicotinic acid 5.0 mg; DL-Calcium Pantothenate 5.0 mg; Vitamin B12 0.1 mg; P-aminobenzoic acid 5.0 mg; Lipoic acid 5.0 mg. 维生素溶液用0.2 μm无菌滤膜过滤除菌，在培养基使用前加入.
Mp培养基是含有5% (质量分数) 微晶纤维素(MCC)的M溶液. Mp培养基的除氧过程参见厌氧操作手册[10]，首先采用煮沸法去除M培养液中的氧气，然后取9.5 mL已除氧的M培养液于含有0.5 g MCC且充满N2的15 mL厌氧管中，最后加塞、 加盖密封，115℃灭菌30 min，使用前加入0.02 mL无菌的维生素溶液. 厌氧滚管参照改进的亨特厌氧滚管技术[11]制作而成，滚管中的固体培养基包含4.5 mL M培养液，0.1 g MCC和0.05 g吉兰胶.
取1 mL采集于青藏高原若尔盖高寒湿地的泥水混合物按10%的接种量接种于Mp培养基，30℃静置培养. 待出现明显的纤维素降解现象后以5%的接种量转接至新鲜的Mp培养基. 每次转接之前，收集1 mL样品用于提取总基因组DNA，利用聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)检测微生物群落结构的变化，直到分子指纹稳定，获得群落组成结构稳定的富集培养物为止.
以群落结构稳定的富集培养物为菌种，以0.5 mL的接种量接种至纤维素厌氧滚管中，滚动滚管使菌液均匀地被培养基吸收，然后将滚管置于30℃培养. 当滚管管壁上出现明显的水解圈时，在无菌厌氧操作箱(Etelux lab2000)内，挑取水解圈直径大、 形态有差异的菌落至新鲜的Mp培养基中培养. 再次观察到明显的纤维素降解现象后，再分别提取分离获得的各个复合系的DNA，以细菌16S rDNA全长引物27F和1525R[12]，古菌16S rDNA全长引物21F和958R[13]，分别进行PCR扩增，然后连接、 转化并测序.
称取0.5 g富集培养物，利用土壤DNA提取试剂盒(Fast DNA SPIN Kit for Soil，MPBio)提取基因组DNA.
以富集培养物基因组DNA为模板对16S rDNA的V3区进行PCR扩增. 扩增引物采用细菌通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和518R(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)，引物由英潍捷基生物技术有限公司合成，其中引物338F的5′端连有GC夹板(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGG GGCGGGGGCACGGGGGG-3′)，以提高在后期DGGE电泳时的解链范围[14]. 50 μL的PCR扩增体系为：模板DNA 50 ng，正反向引物各2 μL(10 μmol ·L-1)，Taq Master Mix(康为世纪)25 μL，补足无菌超纯水(Milli-Q，120℃灭菌15 min)至50 μL. 扩增条件：94℃预变性5 min，退火温度从65℃到55℃每循环依次降0.5℃，每个温度1个循环，每个循环94℃变性1 min，退火50 s，72℃延伸30 s，之后10个循环为94℃变性1 min，55℃退火50 s，72℃延伸30 s，最后在72℃下延伸10 min，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物. 采用DcodeTM通用突变检测系统(Bio-Rad)对PCR扩增产物进行电泳分离. DGGE聚丙烯酰胺凝胶浓度为8%，变性剂(尿素和去离子甲酰胺的混合物)梯度为40%~60%. 电泳条件：在电泳缓冲液1xTAE中，在每个点样孔中加入45 μL PCR扩增产物，电压60 V、 温度60℃条件下电泳17 h. 电泳结束后，将凝胶在EB溶液中染色15 min，然后放入去离子水中脱色10 min，用YLN-2000凝胶成像分析系统观察结果并拍照，获得DGGE图谱，最后用无菌手术刀将DGGE图谱中亮度大的条带切下，置于1.5 mL无菌离心管中，-20℃保存.
采用巢氏PCR扩增富集培养物的古菌基因组DNA. 第一轮PCR扩增采用古菌全长引物21F(5′-TTCCGGTTGATCCTGCCGGA-3′)和958R(5′-YCCG GCGTTGAMTCCAATT-3′). 50 μL的 PCR扩增体系：模板DNA 50 ng，正反向引物各2 μL(10 μmol ·L-1)，TaqTM(Takara)0.25 μL(5 U ·μL-1)，dNTPs(Takara)4 μL(各2.5 mmol ·L-1)，10×PCR buffer(Takara)5 μL，补足无菌超纯水至50 μL. 扩增条件：94℃预变性5 min，之后30个循环，每个循环94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，最后在72℃下延伸5 min. 第二轮PCR扩增采用5′端带GC夹子古菌引物340F(5′-CCTACG GGGYGCASCAG-3′)和519R(5′-TTACCGCGGC KGCTG-3′)进行扩增[15]. PCR扩增体系同上，扩增条件：94℃预变性5 min，之后30个循环，每个循环94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，最后在72℃下延伸5 min. 用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物. DGGE变性梯度为50%~70%，其他条件与前面描述的一致.
将上述回收的胶条用无菌超纯水清洗2次后用枪尖捣碎，加入约30 μL无菌超纯水(以浸没胶条为准)， -20℃放置12 h. 从细菌PCR-DGGE胶上回收的条带用不带GC夹子的338F和518R进行第二轮PCR扩增，扩增条件与用GC338F和518R作为引物的PCR扩增条件一致. 从古菌PCR-DGGE胶上回收的胶条用不带GC夹子的340F和519R进行PCR扩增，扩增条件与用GC340F和519R作为引物的PCR扩增条件一致. 产物用PCR产物回收试剂盒(OMEGA)纯化回收后连入pGEM-T载体(Promega)，挑选阳性克隆子交由北京博迈德科技发展有限公司测序. 登录NCBI网站，将测序结果用Blast软件与库中已有的16S rDNA序列进行比对，下载同源性最高的序列. 采用MEGA 5.0软件的Neighbor-Joining法进行系统发育树分析(检验次数为1000次)，构建系统发育树.
复合系气体代谢产物直接利用气相色谱-质谱联用仪(岛津GC-MS 2010Plus)测定，其中采用高纯氦气作为载气，气相色谱柱箱温度为35℃，进样口温度为150℃. 质谱仪采用电子电离(EI)方式，离子源温度为200℃，扫描方式为选择离子检测方式(SIM)扫描.
为了获得简单的降解纤维素产甲烷复合系，首先要建立一个微生物群落组成结构稳定的降解纤维素复合系，作为开展分离试验的基础. 本研究采用高结晶度的MCC[16]作为培养底物，对沼泽地泥水混合物中的微生物进行富集培养. 提取每代培养物的基因组DNA，对所有DNA的16S rDNA V3区域进行细菌PCR-DGGE分析. 在富集培养过程中，培养物的微生物群落组成结构的变化可以通过DGGE图谱中条带位置和亮度的变化反映. 如图 1所示，第4代和第5代的主要组成条带位置和亮度均未发生变化. 这表明，富集培养至第4代，培养物中细菌的群落组成结构已经稳定. 利用DGGE技术对富集培养物古菌的群落组成结构进行分析发现，富集培养至第4代，培养物的古菌群落组成结构已经稳定(结果未展示). 至此，获得了稳定的降解纤维素复合系.
 | 图 1 16S rDNA PCR-DGGE图谱 Fig. 1 PCR-DGGE patterns of the 16S rDNA fragments from different generation |
将上述稳定的降解纤维素复合系以5%的接种量接种至底物为10 g MCC的100 mL Mp培养基中，以验证该复合系的纤维素降解能力. 如图 2所示，复合系在30℃培养7 d后，底物MCC发生了明显的降解现象. 未接种复合系的培养基在30℃培养7 d后，培养液无色透明，底物MCC致密，仍为粉末状，接种复合系的培养基在30℃培养7 d后，培养液浑浊，并且培养液中有大量的气泡产生，底物MCC腐烂膨胀，胶着成块，难以混合均匀. 对比可知，该复合系降解纤维素能力明显.
 | 图 2 培养7 d后复合菌系对纤维素的降解 Fig. 2 Degradation of cellulose by microbial community after 7 days of incubation |
由于16S rDNA测序结果和系统发育树分析能够在一定程度上揭示上述复合系中各功能菌群之间的关系，所以对细菌和古菌DGGE图谱中优势条带进行16S rDNA测序，其中富集培养物古菌DGGE图谱显示古菌群落结构简单，DGGE条带的16S rDNA测序结果只有一种. 如图 3所示，将细菌DGGE图谱优势条带的16S rDNA测序结果输入NCBI数据库中进行比对，然后下载其最相近的基因序列构建系统发育树. 而古菌DGGE优势条带的16S rDNA序列在NCBI数据库中的比对结果为Methanobacterium subterraneum DSM11074T.
 | 图 3 纤维素厌氧降解细菌的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic tree of anaerobic cellulolytic bacteria |
结合细菌DGGE图谱、 细菌系统发育树图和古菌测序结果可知，在群落结构已稳定的培养物中，优势菌群为Clostridium cellulovorans(条带B6)、 Clostridium fimetarium(条带B5)、 Trichococcus flocculiformis(条带B2)、 Parabacteroides merdae(条带B3)和M. subterraneum. 其中T. flocculiformis占据最大优势，C. fimetarium其次，P. merdae和C. cellulovorans数量相对较少. M. subterraneum则是测序得到的唯一的古菌. 复合系中的微生物可以分为以下3个功能菌群.
(1) 纤维素水解菌 条带B6代表的细菌，能够降解纤维素，是梭菌属的一种.
条带B6的16S rDNA测序结果与嗜纤维梭菌C. cellulovorans strain 743B有95%的同源性. Sleat等[17]在木质纤维素反应器中首次分离得到嗜纤维梭菌，并研究得出，该菌是严格厌氧的中温微生物，能够降解纤维素、 纤维二糖和葡萄糖，该菌降解纤维素或者纤维二糖的代谢产物为丁酸盐、 乳酸盐、 乙酸盐、 甲酸盐、 H2和CO2. 之后Doi等[18]研究发现在嗜纤维梭菌中存在纤维小体结构. 而纤维小体是多种纤维素酶、 半纤维素酶依靠锚定粘附机制形成的一种多酶复合体，能高效降解天然纤维素材料[19]. 上述资料表明嗜纤维梭菌具有直接降解纤维素的能力. 由此推断，在富集培养物纤维素降解中，梭菌属的B6直接降解纤维素，将其转化为容易利用的小分子糖和有机酸，提供给非纤维素水解菌利用. 但是DGGE图谱显示在富集培养物微生物群落组成结构稳定后，B6所代表的细菌在整个群落中占的比例比较小. Wilson[20]研究发现，直接水解利用纤维素的微生物在参与降解纤维素的所有微生物中所占比例比较小. 这一结果与本研究结果一致.
(2) 非纤维素水解菌 条带B2、 B3、 B5代表的细菌，在整个群落中占据优势地位.
条带B5的16S rDNA测序结果与C. fimetarium strain Z-2189有98%的同源性，菌株B5可以看作是C. fimetarium. 据文献报道，C. fimetarium分离自低温环境下发酵分解的牛粪，是严格厌氧的低温微生物，能够降解纤维二糖、 麦芽糖、 半乳糖、 果糖和葡萄糖，发酵糖类的终产物为乙酸盐、 乙醇、 乳酸盐、 甲酸盐、 H2和CO[21]2. 然而目前尚鲜有关于C. fimetarium能够利用纤维素的报道. 这表明在降解纤维素产甲烷的微生物食物链中，菌株B5位于菌株B6的下一级，利用菌株B6降解纤维素的代谢产物提供自身生长所需物质. 16S rDNA测序结果显示，条带B4的16S rDNA测序结果与C. fimetarium strain Z-2189也有98%的同源性，但是条带B4在富集培养的起始过程中出现后不久便消失. 推测这一现象的可能原因是条带B4和B5所代表的微生物在纤维素降解过程中发挥的作用相似，为了保证群落结构的稳定性和可利用资源最大化，条带B4所代表的微生物最终被淘汰.
细菌DGGE图谱显示(图 3)，条带B2代表的细菌在整个群落中占据最大优势. 测序结果表明，条带B2的序列与束毛球菌T. flocculiformis strain DSM 2094相似度高达100%，可以认为条带B2代表的微生物是束毛球菌. 据文献报道，絮状束毛球菌是分离自膨胀的污泥和池塘沉积物的兼性厌氧微生物，能够发酵纤维二糖、 果糖、 乳糖、 半乳糖、 蔗糖、 木糖和葡萄糖产酸[22]. 由此可以推断，絮状束毛球菌能够分解代谢多种类型的单糖和二糖. 此外，还有研究表明，絮状束毛球菌能够在低于4℃的低温环境中生长，在静置培养和振荡培养时会改变细胞形态从而最大限度获取营养[23]. 絮状束毛球菌的这些代谢特性表明，该菌株生存适应能力强. 这可能是T. flocculiformis从第1代到第5代都在整个群落中占据优势地位的原因. 束毛球菌属的B2与梭菌属的B5都能够代谢纤维二糖等小分子糖，在纤维素代谢产物的进一步转化过程中发挥着重要作用.
16S rDNA测序结果显示，条带B3代表的细菌与拟杆菌P. merdae strain JCM 9497的相似度为93%，菌株B3属于拟杆菌属. 拟杆菌是专性厌氧微生物，分解利用蔗糖、 乳糖、 木糖和葡萄糖[24, 25]. 研究资料表明，拟杆菌属在纤维素降解过程中发挥着重要的作用[26]，同时也是为数不多的厌氧发酵产氢细菌之一[27, 28]. 在已稳定的复合系中，纤维梭菌属的B6直接水解纤维素，梭菌属的B5、 束毛球菌属的B2和拟杆菌属的B3利用菌株B6的代谢产物生长并将其转化为小分子有机酸、 H2和CO2. 这4株菌在纤维素降解过程中发挥的功能不同，并且稳定共存，共同将纤维素转化为小分子化合物.
(3) 产甲烷古菌 富集培养物古菌的DGGE条带的16S rDNA测序结果显示只有一种菌，该菌与产甲烷杆菌Methanobacterium subterraneum DSM11074的同源相似度为98%. 据文献报道，该菌是嗜碱、 耐盐的专性厌氧、 广温产甲烷古菌，能够利用H2和CO2或者甲酸盐作为底物生长，并代谢产CH4[29]. 由此推断，在复合系中，M. subterraneum位于微生物食物链的终端，将纤维素水解细菌和非纤维素水解细菌共同降解纤维素的终产物转化为CH4.
虽然这些菌群在降解纤维素产甲烷过程中所发挥的具体作用和相互之间的关系，有待进一步阐明，但是可以明确，纤维素水解菌(C. cellulovorans)水解纤维素将难降解的大分子化合物转化为易利用的小分子化合物，非纤维素水解菌(C. fimetarium、 T. flocculiformis和P. merdae)进一步发酵小分子化合物为甲酸盐、 乙酸盐、 H2和CO2，最后产甲烷古菌(M. subterraneum)将甲酸盐、 H2和CO2转化为CH4. 复合系中，不同的功能菌群各司其职，稳定共存，最终完成纤维素转化为CH4这一生物转化过程.
虽然已经获得了稳定的降解纤维素产甲烷复合系，但是复合系中微生物的种类大于5种，再加上DGGE技术主要反映的是优势微生物种群，该复合系仍然比较复杂，难以进行代谢控制和遗传改造. 因此进一步利用厌氧滚管技术，在稳定复合系的基础上开展简单的降解纤维素产甲烷复合系的筛选试验. 以稳定的复合系培养物作为菌种，取0.5 mL接种至纤维素厌氧滚管中，置于30℃培养约20 d后观察到明显的纤维素水解圈，如图 4所示，水解圈以菌落为中心，形成不规则的透明区域. 在厌氧工作站中挑取水解圈直径大，形态各异的菌落12个(A1、 A2、 B1-B4、 C1-C4、 D1、 D2)接种至新鲜的Mp培养基，置于30℃培养. 约7~14 d后，A2、 B1-B4和C1-C4观察到纤维素降解现象. 此后，检测每个复合系的气体代谢产物，发现复合系A2具有产甲烷能力. 将复合系A2传代培养，对其传代培养物的气体代谢产物进行分析发现，其中含有大量CH4和CO2，GC-MS分析结果如图 5所示，CH4含量约占厌氧管顶空气体的35.88%，CO2含量约占22.22%.
 | 图 4 纤维素水解圈 Fig. 4 Different zones of cellulose hydrolysis with visible colonies |
 | 图 5 复合系A2的气体代谢产物的GC-MS图 Fig. 5 GC-MS chromatogram of the gas produced by complex A2 |
提取复合系A2的基因组DNA，进行PCR扩增，然后连接、 转化，挑选约90%的阳性克隆进行大批量测序. 结合扫描电镜观察结果(图片未给出)和大批量测序结果，发现复合系A2仅由4株菌组成. 如表 1所示，复合系A2由Clostridium glycolicum、 T. flocculiformis、 P. merdae和M. subterraneum这4株 菌组成. 其中，乙二醇梭菌C. glycolicum是在微碱性环境下生长的厌氧微生物，降解纤维素、 乙二醇、 丙二醇、 蔗糖和葡萄糖. 乙二醇梭菌代谢乙二醇的产物为乙酸盐和乙醇，代谢纤维素产CO2和H2[30]. 由于产甲烷古细菌M. subterraneum在代谢产甲烷过程中消耗H2，导致气体代谢物中H2的浓度较低， H2未能被检测出来. 在这一简单复合系中，乙二醇梭菌发酵水解纤维素，絮状束毛球菌和拟杆菌再进一步分解利用乙二醇梭菌的代谢产物纤维二糖和葡萄糖等，这3株菌共同将纤维素转化为H2、 CO2、 乙酸盐和甲酸盐，在此基础上，M. subterraneum最后将H2、 CO2和甲酸盐转化为CH4，至此，4株菌共同作用完成了纤维素生物转化产甲烷的过程. 纤维素生物降解产甲烷是一个复杂的过程，需要多种微生物的共同参与. 这一简单的降解纤维素产甲烷复合系的发现为研究可控的纤维素产甲烷复合工程菌提供了可能.
 | 表 1 复合系A2的近缘种微生物Table 1 Identities of complex A2 |
(1) 结合富集培养法、 DGGE分子指纹检测技术、 厌氧滚管技术和16S rDNA测序技术，建立了一种筛选简单降解纤维素产甲烷复合菌系的方法，并分离到一个由4株菌构成的降解纤维素产甲烷的稳定菌系.
(2) 获得的4菌复合系能够降解纤维素，产生约为顶空气体35.88%的CH4. 复合系中，C. glycolicum水解纤维素，M. subterraneum进一步将代谢中间产物转化为CH4.
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