2014, Vol. 35
2. 中国科学院沈阳应用生态研究所污染生态与环境工程重点实验室, 沈阳 110016;
3. 大庆油田有限责任公司第二采油厂中心化验室, 大庆 163414
2. Key Laboratory of Terrestrial Ecological Processes, Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shenyang 110016, China;
3. Center Laboratory of No. 2 Oil Production Plant, Daqing Oilfield Company Ltd., Daqing 163414, China
硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria, SRB)是一类以SO2-4为最终电子受体进行能量代谢生成S2-(H2S)的厌氧微生物的统称[1, 2]. SRB种类繁多，广泛分布于油藏及采出水[3, 4, 5]、 海床、 底泥等缺/厌氧环境中，并在碳、 氮、 硫等元素的生物地球化学循环中发挥着重要作用[6].
在石油开采工业中，向油藏中注水以提高原油采收率(简称“水驱”)是最重要的采油方法之一. 随着水驱的进行，注入水中含有的SO2-4促进了油藏及管线中SRB的代谢活动，进而引发一系列的生产及环境问题，如SRB会导致油田输油设备及注入水设备等金属设备的腐蚀; SRB的代谢产物H2S还会导致油藏酸化(souring)，降低原油和天然气的质量，并严重危害工人的身体健康. 油藏及采出水中SRB危害的有效控制是石油工业中亟待解决的重要课题之一.
目前，控制油田SRB代谢活性的方法主要是使用化学杀菌剂. 常用的化学杀菌剂有戊二醛、 四羟甲基硫酸磷等[7, 8, 9]. 但是，长时间使用这些化学杀菌剂，SRB会对其产生耐药性[10, 11]; 此外，化学杀菌剂具有较高的环境污染风险[9]. 近几年来，基于调节硝酸盐还原菌(nitrate-reducing bacteria, NRB)活性以抑制SRB活性的“生物抑制法”受到广泛重视[12, 13][10, 11]. 有研究表明，向油藏中加入NO-3激活油藏中的异养硝酸盐还原菌(hNRB)使其与SRB竞争电子供体(有机碳源)可实现对SRB代谢活性的竞争性抑制[14]. 此外，NO-3的存在还会促进油藏中的自养硝酸盐还原-硫化物氧化菌(nitrate-reducing, sulfide-oxidizing bacteria, NR-SOB)的代谢活性，从而把SRB已经产生的H2S去除. 另一些研究则显示，NO-3还原过程中产生的NO-2对SRB细胞内亚硫酸盐还原酶活性具有强烈的抑制作用[15]; NO-3还原过程中，系统的氧化还原电位升高，使得SRB驱动的SO2-4还原作用无法进行. 与化学杀菌剂等方法相比，“生物抑制法”环境友好、 经济可行. 尽管如此，油藏环境的巨大异质性和SRB种群组成的多样性[16]决定了NO-3抑制油藏酸化作用机制的复杂和不确定性，该过程所需NO-3的剂量和抑制作用效果常受油藏中SRB的种群组成、 注水水质、 有机物浓度等因素的影响. 因而，针对特定油藏实际优化生物控制过程以油藏酸化的需要而具体问题具体分析[17].
大庆油田是我国开发较早、 水驱历史较长的特大油田. 目前，在不同区块油藏及其采出水中SRB的数量通常可达102~105 cell ·mL-1，H2S浓度接近0.5 mmol ·L-1，出现了不同程度的酸化问题[18]. 近年来，虽然已有一些研究者开展了物理法(如紫外杀菌法)或化学法控制油藏SRB危害研究，但生物抑制法的有关研究尚不多见，针对特定油藏环境条件下利用NO-3和NRB抑制SRB的作用效果和机制等研究仍十分薄弱[19]. 本研究从大庆油田水驱油藏中分离筛选到1株高效的硝酸盐还原菌DNB-8，并考察了不同NO-3浓度对于抑制大庆油田水驱油藏采出水中SRB富集培养物活性的影响，旨在探讨基于NO-3和NRB抑制大庆油田SRB活性的作用效果与机制，并为该油藏酸化的生物控制研究提供理论依据.
用于NRB分离筛选和SRB富集的油藏采出水取自大庆油田水驱油藏的某油水分离罐. 采用预先灭菌且充满高纯N2(99.99%)的玻璃瓶采集2.0 L左右的采出水(采出水完全充满玻璃瓶以避免接触空气)，尽快(约15 h)运抵实验室并立即开展菌种富集和筛选等实验.
NRB分离筛选的培养基(M-1培养基)成分为(g ·L-1)：柠檬酸钠5.0，KNO3 2.0，MgSO4 ·7H2 O 0.2，KH2PO4 0.5，K2HPO4 1.0，琼脂 20.将培养基的pH调至7.2~7.5，并在121℃灭菌20 min备用. NRB的液体培养基不含琼脂，其他成分同M-1培养基.
NRB自养氧化S2-培养基(M-2培养基)成分为(g ·L-1)：NaHCO3 5.0，KNO3 2.0，K2HPO4 0.5，KH2PO4 1.0，MgSO4 ·7H2 O 0.2，蒸馏水 1.0 L，pH=7.5.121℃灭菌20 min放凉后加入适量经0.22 μm滤膜过滤除菌的高浓度Na2S ·9H2 O贮备液，使培养基中S2-终浓度达1.89 mmol ·L-1.
SRB富集培养基(M-3培养基)成分为(g ·L-1)：乳酸钠 8.0，酵母膏 2.0，MgSO4 ·7H2 O 0.4，KH2PO4 1.0，Vc 0.2，蒸馏水1.0 L，pH=7.2.
NO-3或NO-2抑制SRB批次实验用培养基：以M-3为基础，另加入不同浓度的KNO3或NaNO2(具体见1.4节)，其他成分不变.
本研究中所有培养基的配制、 菌种转接等操作均参照Hungate厌氧培养技术进行.
采用夹层平板法结合Hungate厌氧微生物分离筛选法筛选和纯化NRB. 取1.0 mL采出水，用灭菌M-1液体培养基进行10倍梯度稀释，然后涂布M-1固体夹层平板，并用液体石蜡将皿盖与皿底间缝隙封闭，最后置于45℃条件下恒温培养. 当夹层平板上出现单菌落时，迅速将其挑出接入液体培养基中继续培养. 重复使用夹层平板法和液体培养法，直至获得纯菌株. 选取液体培养基中硝酸盐还原活性最强的菌株，作为开展后续抑制实验的NRB菌株.
采用细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302，TIANGEN，北京)提取目的NRB菌株的基因组DNA，采用细菌通用引物27f-1492r引物(27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; 1492r: 5′-TACCTTGTTACGACTT-3′)扩增其16S rRNA基因. PCR扩增反应条件为：95℃ 5 min; 94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环，72℃ 7 min. PCR产物经TA克隆法进行序列测定(由北京六合华大基因科技股份有限公司完成序列测定). 测序完成后，采用RDP (Ribosomal database project)中的Chimera Detection程序对所获得的16S rDNA序列进行嵌合体检验，然后通过GenBank数据库中的BLASTn软件进行基因同源性比对分析. 菌株的生理生化实验参考文献[20]完成.
取一定体积的处于对数生长期的目的NRB菌液，在8000 r ·min-1离心5 min搜集菌体，分别用适量的新鲜配制的液体M-1和M-2培养基重悬菌体，然后按5%比例分别接种M-1和M-2液体培养基中，考察NRB菌株异养NO-3还原和自养氧化S2-能力. 不接菌的对照组补加等体积的灭菌的相应液体培养基，每个处理设3个重复.
用无菌注射器取10 mL采出水加入到含有100 mL 已灭菌的M-3培养基的350 mL血清瓶中(顶空气体为高纯N2)，在45℃条件下富集培养6~10 d. 按1.3中相同的方法搜集SRB富集培养物菌体，备用.
NO-3及NRB菌株对SRB富集培养物活性的抑制通过批次实验完成. 将M-3培养基煮沸，在高纯N2保护条件下放凉至室温，然后分装200 mL培养基至总体积为250 mL的血清瓶中，并在高纯N2保护条件下迅速用橡胶塞密封血清瓶. 灭菌后再用无菌注射器补加适量体积的经0.22 μm滤膜过滤除菌的高浓度的KNO3或NaNO2储备液. 实验共设“加NO-3”和“加NO-2”两组. 在第一组中，血清瓶内NO-3的终浓度分别为0.5、 1.0、 3.0、 6.0、 10.0 mmol ·L-1; 第二组中NO-2的终浓度梯度为0.6、 1.0、 2.5、 5.5、 8.5 mmol ·L-1. 两个实验组需要接种SRB富集培养物和/或NRB菌株，其接种比例为5%. 第一组实验中同时设不接种NRB的对照(补加与接种NRB菌液等体积的除氧无菌水). 每个处理设3个重复. 所有血清瓶置于45℃培养箱内静置、 避光培养，定期取样测定SO2-4、 NO-3、 NO-2、 NH+4和S2-的浓度变化. 取样时先将血清瓶倒置，用预先充满3 mL高纯N2的注射器将气体注入培养瓶中，然后再用注射器抽出3 mL液体样品，经8000 r ·min-1离心10 min后取上清液用于测定各目标离子的浓度.
采用夹层平板法共获得具有硝酸盐还原功能的菌株8株. 其中，编号为DNB-8的菌株在本实验条件下NO-3还原活性最强，故后续的相关研究以该菌株为基础展开. DNB-8为革兰氏阴性菌，细胞呈短杆状，无芽孢，大小约为0.4 μm×1.0 μm. 菌落呈圆形，乳白色，且边缘整齐、 光滑. 经16S rRNA基因序列同源性比对及生理生化特征(表 1)分析，初步将菌株DNB-8 鉴定为施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri).
 | 表 1 菌株DNB-8的生理生化特征Table 1 Physiological and biochemical properties of the bacterial strain DNB-8 |
DNB-8为兼性营养型菌株. 当培养基中存在有机碳源时，该菌株能进行异养NO-3还原代谢，其中间代谢产物为NO-2 [图 1(a)]. 整个代谢过程中培养体系的NH+4浓度基本保持稳定，意味着NRB-8在厌氧异养NO-3还原过程中未产生NH+4或产生的NH+4被迅速转化.
 | 图 1 菌株DNB-8异养NO-3 还原及自养NO-3还原-硫化物氧化活性 Fig. 1 Heterotrophic nitrate-reducing and chemolithotrophic nitrate-reducing, sulfide-oxidizing activity of DNB-8 |
在自养条件下，NRB-8表现出NO-3还原-硫化物氧化活性：反应体系中S2-的初始浓度为1.892 mmol ·L-1， 120 h后S2-被完全氧化，对应的氧化速率为0.016 mmol ·(L ·h)-1[图 1(b)].
SRB富集培养物具有较强的SO2-4还原活性. 72 h之内，培养体系中初始浓度为1.693 mmol ·L-1的SO2-4被完全消耗，其中的96.4%被还原生成S2-(1.633 mmol ·L-1).
培养体系中未接种NRB的处理中，不同NO-3浓度对SRB富集物硫酸盐还原活性的抑制效果呈现出明显差异. 本实验中共有2组处理的初始NO-3浓度低于1.0 mmol ·L-1，在这些处理中，NO-3、 SO2-4等离子的变化趋势极为相似，为简便起见，本研究仅以初始NO-3浓度等于1.0 mmol ·L-1的处理[图 2(a)]为代表做结果阐释. 当初始NO-3浓度≤1.0 mmol ·L-1时(低NO-3条件)，SRB富集培养物优先利用SO2-4为电子受体进行代谢，产生H2S[图 2(a)]. 第2 d，培养体系中SO2-4浓度从初始的1.4 mmol ·L-1时迅速降低至0.14 mmol ·L-1时，NO-3还原开始启动. 至培养结束时，1.0 mmol ·L-1的NO-3全部被还原，产生的NH+4浓度为0.89 mmol ·L-1，即89%的NO-3被异化还原成NH+4. 整个培养实验期间未检测到NO-2的累积. 该结果还表明，大庆油田采出水中的SRB细胞内存在异化NO-3还原生成NH+4的代谢途径[21, 22]，该途径也被称为氨化作用(ammonification); 另一方面，加入低浓度的NO-3对SRB富集培养物硫酸盐还原活性无抑制作用.
 | 图 2 碳源充足条件下硝酸盐抑制SRB富集培养物活性Fig. 2 Inhibition of sulfate reduction in enrichment cultures of SRB by nitrate under organic substrate unlimited conditions |
当培养体系中初始NO-3的浓度>1.0 mmol ·L-1时(高NO-3浓度)，SRB富集培养物则优先利用加入的NO-3为电子受体进行异养硝酸盐代谢[图 2(c)]. 本实验设计的1.5、 3.0、 6.0 mmol ·L-1这3个处理中，各离子浓度变化趋势也非常相似，以初始NO-3浓度为6.0 mmol ·L-1的处理[图 2(c)]为例进行结果阐述. 在高NO-3浓度条件下，SRB富集培养物优先利用NO-3为电子受体进行异化硝酸盐还原生成NH+4，NO-2为中间代谢产物. 在本实验条件下，SRB富集培养物的硝酸盐还原活性较强，加入到培养体系中的6.0 mmol ·L-1的NO-3在2 d内完全被耗尽，同时产生了5.0 mmol ·L-1的NO-2和0.56 mmol ·L-1的NH+4. 第2~3 d期间，所产生的NO-2进一步向NH+4转化，直至第3 d NH+4浓度达到最高(3.44 mmol ·L-1). 第3.75 d， NO-2完全耗尽，SRB富集培养物的硫酸盐还原过程开始启动，并在约2 d内迅速将SO2-4完全还原生成了H2S[图 2(c)].
培养体系中存在NRB且初始NO-3浓度≤1.0 mmol ·L-1的条件下，NO-3还原和SO2-4还原同时启动[图 2(b)]，24 h后即有H2S产生. 第3 d时，培养体系中NO-3和SO2-4几乎同时耗尽. 值得注意的是，在第2 d开始，培养瓶内检测到NH+4浓度的增加，其最高浓度达到0.530 mmol ·L-1. 整个培养过程中，未检测到NO-2的存在及累积.
当培养瓶内初始NO-3浓度>1.0 mmol ·L-1时，接入NRB后，NO-3在2 d内被迅速还原，全部生成了NO-2[图 2(d)]. 所产生的NO-2又在随后的0.5 d内耗尽. 第3 d开始，SO2-4还原开始启动，且在此后2 d内将SO2-4全部还原产生H2S. 整个培养实验期间，未检测到NH+4.
NO-2对SRB富集培养物SO2-4还原活性的抑制作用如图 3所示. 与NO-3作用相比，较低浓度的NO-2(0.610 mmol ·L-1)可较好地抑制SO2-4还原活性. 但是，当培养瓶中的NO-2逐渐降低至0.45 mmol ·L-1时，SRB富集培养物SO2-4还原活性开始启动[图 3(a)]. 此后的几天内，体系中所有的SO2-4均被还原生成H2S; 当培养瓶中NO-2初始浓度较高时，即使NO-2被完全耗尽后的24 h内，SRB富集培养物的SO2-4还原活性仍处于抑制状态[图 3(b)].
 | 图 3 亚硝酸盐抑制SRB富集培养物活性 Fig. 3 Inhibition of sulfate reduction in enrichment cultures of SRB by nitrite |
大庆油田油藏内及其采出水中存在多种SRB[18]. 深入认识SRB种群的代谢特点对于应用生物控制技术抑制油藏酸化具有至关重要的作用. 本研究结果表明，大庆油田采出水中的SRB富集培养物具有异化NO-3还原生成NH+4的代谢途径[图 2(c)、 图 3(b)]. 为了排除富集培养物中可能存在的杂菌对该代谢途径的贡献，本研究利用Hungate厌氧培养技术从SRB富集培养物中分离筛选到1株SRB纯菌株. 进一步的研究证实该纯菌株具有明确的异化NO-3还原生成NH+4的代谢活性(结果未给出). 已有研究显示，在所有的SRB中，只有少数种类的SRB具有NO-3还原成铵的能力，如Desulfobulbus propionicus[23]、 Desulfobacterium catecholicum[22, 24]以及Desulfovibrio属的部分种[25, 26, 27, 28]. 当环境中同时存在NO-3和SO2-4时，上述大多数SRB菌株可以同时利用两者电子受体. 但Seitz等[25]报道了菌株Desulfovibrio desulfuricans Essex 6优先利用NO-3而非SO2-4; 对Desulfovibrio desulfuricans菌株C4S的研究表明，当培养基中加入高浓度的SO2-4(1.5 或5.0 mmol ·L-1)，则菌株的NO-3还原成铵的活性受到强烈抑制. 即使SO2-4被消耗殆尽，NO-3还原成铵的活性在随后的10h内仍没有恢复(NO-3浓度始终维持在5 mmol ·L-1)[25, 29]. 本实验结果与以往研究均有所不同，当环境中同时存在NO-3和SO2-4时，NO-3浓度的高低对大庆油田采出水中的SRB对两者电子受体选择的“偏好性”具有重要影响：NO-3浓度≤1.0 mmol ·L-1的情况下，SRB种群优先利用SO2-4[图 2(a)]; 而当NO-3浓度>1.0 mmol ·L-1时，SRB可同时利用两者电子受体，甚至优先利用了NO-3[图 2(c)]. 这些差异可能是由于大庆油田采出水中的SRB种群与以往研究所使用的菌种不同所致. 该结果同时意味着，如果单纯采用投加NO-3的方式抑制SRB活性和酸化，NO-3的工作浓度高于1.0 mmol ·L-1是必要的; 另一方面，NO-3投加的方式应采用连续投加或保持采出水中NO-3的浓度不低于1.0 mmol ·L-1. 否则，一旦NO-3被消耗，SRB的SO2-4还原活性将恢复.
NO-3抑制油藏酸化的作用机制复杂，主要有如下4种认识：①NO-3激活或促进了油藏中hNRB的生长代谢并优先利用了油藏中的电子供体(如小分子脂肪酸等有机物)，进而竞争性抑制SRM的活性[13, 14, 30]; ②硝酸盐还原-硫化物氧化菌(NR-SOB)以NO-3为电子受体将SRB产生的H2S重新氧化掉(比如，氧化成SO2-4或单质硫等); ③NO-3还原过程中产生中间代谢产物，如NO-2等对硫酸盐还原菌的抑制效应[12, 31]. NO-2可强烈抑制SRM细胞内的亚硫酸盐还原酶(Dsr)活性[15]. ④NRB代谢过程中引起环境中氧化还原电位的大幅升高(>-150 mV)，进而使SRB的SO2-4还原活性受到抑制.
基于本研究结果，在NO-3的浓度较低时，hNRB和SRB对有机碳源的竞争作用并不明显. 如[图 2(b)]所示，在接种了NRB的培养瓶中监测到了NH+4的累积，而这部分NH+4极有可能源自SRB的代谢而不是NRB，因为接种的NRB在厌氧条件下利用NO-3时不产生NH+4[图 1(a)]. 该结果表明尽管可能存在NRB对有机碳源的竞争，SRB异养NO-3还原成NH+4的代谢过程未受明显影响. 然而，当培养体系中存在较高NO-3时，NRB表现出了对SRB的底物竞争性抑制效应[图 2(c)]：NRB优先利用了有机底物进行异养NO-3还原代谢，而SRB的活性受到抑制. 当然，需要注意的是不能忽视中间产物NO-2的累积对于SRB硫酸盐还原活性抑制的贡献. 图 3中显示的实验结果也进一步证实NO-2的抑制作用. 尽管如此，也有许多研究表明，不同SRB(甚至同一种的不同菌株间)对NO-2抑制的敏感程度不一. 许多菌株细胞内含有细胞色素c亚硝酸盐还原酶基因(nrf)，该基因的诱导表达可使SRB通过亚硝酸盐还原酶解除NO-2的抑制[32]. 图 3(b)中的实验结果同时明确证明，大庆油田采出水中的SRB能够还原NO-2生成NH+4，其细胞内含有亚硝酸盐还原酶.
虽然本研究中没有对培养瓶内的氧化还原电位进行观测，但推测培养体系中氧化还原电位的变化幅度不大，未对SRB的代谢行为产生实质性影响，因为从图 2(c)、 2(d)都可以看出，一旦NO-2耗尽，SRB的SO2-4还原代谢经短暂停滞后便可迅速启动，进而快速产生了H2S. 因而，在本研究条件下，氧化还原电位不是影响SRB活性的主要因素.
本研究中接种的NRB是一种兼性营养的硝酸盐还原菌，但在有机碳源充足的实验条件下，未能观测到该菌株的NO-3还原-S2-氧化活性. 在接种NRB的培养瓶中，后期产生的H2S浓度没有进一步降低(数据未给出)，这可能是因为NRB菌株更倾向于以有机碳源而非S2-作为电子供体进行代谢. 显然，环境中碳源不足时的情形怎样，或真实油藏环境中是否存在活性更强的NR-SOB等问题尚需进一步研究和探讨.
尽管本研究使用的DNB-8是一株兼性营养的NO-3还原菌，但该菌株在所有处理中仅体现了异养NO-3还原活性而并未展现NO-3还原-S2-氧化活性[图 2(b)、 2(d)]. 这可能因为培养瓶中的培养基成分(比如充足的有机碳源)不适合该菌株进行自养代谢.
单就DNB-8作为hNRB而言，其在抑制SRB的SO2-4还原活性的过程中所发挥的作用似乎因初始NO-3的浓度的高低而不同. 当使用低浓度的NO-3时，由于NRB自身的NO-3还原代谢活性，使环境中原本浓度就不高的NO-3和NO-2浓度进一步迅速降低，间接促使SO2-4还原活性更快启动，从而体现出对于酸化控制的负面作用; 但是，当NO-3浓度较高时，NRB的作用却是“一分为二”的：一方面，通过其对SRB的底物竞争抑制作用和其自身较强的异养NO-3还原活性，可迅速产生较高浓度的NO-2以抑制SRB活性，具有积极作用; 另一方面，DNB-8对于NO-2这一中间代谢产物的快速消耗使NO-2抑制SRB活性的时间相对缩短[图 2(d)]. 这一点显然对于酸化控制是不利的.
简言之，NO-3/NO-2抑制油藏酸化的作用机制复杂，不但受油藏温度、 注水水质等环境因子的影响，而且受SRB种群组成及代谢特点等微生物因素的影响. 因此，对于特定油藏的微生物生理生态学等相关研究仍亟待加强[33, 34]. 另一方面，本研究采用的是SRB的富集培养物和分离筛选到的NRB的纯培养物，鉴于油藏及采出水环境中微生物种群结构的多样性[18, 33]，仍有必要在油田现场开展原位的NO-3抑制SRB实验，以获得更为准确的认识. 只有如此才能发挥生物控制技术的最大功能，达到抑制SRB活性进而消除其危害的目的.
(1)NO-3>1.0 mmol ·L-1或NO-2>0.45 mmol ·L-1可有效抑制SRB富集培养物的SO2-4还原活性.
(2) 补加NO-3抑制大庆油田采出水中SRB富集培养物SO2-4还原活性的主要作用机制是NRB对电子受体的竞争作用以及产生的NO-2对SRB的活性抑制作用.
(3)大庆油田采出水中的SRB富集培养物细胞内存在异化NO-3还原生成NH+4的代谢途径. 采出水中的NO-3还原菌兼具NO-3还原-硫化物氧化活性. 但有机碳源充足的条件下，DNB-8未展现自养NO-3还原-硫化物氧化活性.
致谢： 本研究得到大庆油田有限责任公司第二采油厂技术发展部主任尹中民博士、 刘卫东副主任的大力支持; 在采出液样品采集过程中还得到了第二采油厂中心化验室纪海龙、 郭明、 郝金生、 闵洁、 贾小兵等的热心帮助; 中国科学院沈阳应用生态研究所的史奕研究员在SO2-4等离子浓度测定方面给予了帮助与指导; 中国科学院污染生态与环境工程重点实验室的贾永峰研究员、 王新副研究员也对本研究予以指导，在此一并表示诚挚感谢！
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