环境科学  2014, Vol. 35 Issue (1): 313-318   PDF    
引用本文
游狄杰, 陈晓国, 向荟圯, 欧阳潦, 杨冰. 微囊藻毒素降解菌Paucibacter sp. CH菌的分离鉴定及其降解特性[J]. 环境科学, 2014, 35(1): 313-318.
YOU Di-jie, CHEN Xiao-guo, XIANG Hui-yi, OUYANG Liao, YANG Bing. Isolation, Identification and Characterization of a Microcystin-degrading Bacterium Paucibacter sp. Strain CH[J]. Environmental Science, 2014, 35(1): 313-318.
微囊藻毒素降解菌Paucibacter sp. CH菌的分离鉴定及其降解特性
游狄杰, 陈晓国, 向荟圯, 欧阳潦, 杨冰    
武汉理工大学资源与环境工程学院, 武汉 430070
收稿日期: 2013-4-6; 修订日期: 2013-5-20.
基金项目： 国家自然科学基金项目（21077083）；中央高校基本科研业务费专项 （2012-Ⅳ-095）
作者简介：游狄杰（1987~），男，硕士研究生，主要研究方向为环境微生物学，E-mail：youdijie999@163.com
通讯联系人,E-mail:xiaoguo_chen@tom.com
摘要：从巢湖沉积物中分离出1株MC高效降解菌，命名为CH菌. 根据16S rRNA基因序列分析结果，初步确定该菌为Paucibacter sp.. 该菌能以MCLR为唯一碳源和能源生长，并且在10 h内可将11.6 μg·mL-1的MCLR降解至检测限以下，其一级反应速率常数为0.242 h-1. CH菌降解MCLR的适宜温度为25~30℃，适宜pH为6~9.MCLR降解过程中产生1种含有Adda残基的中间产物，该产物与已报道的ACM-3962菌的降解产物不同，并且反应过程积累终产物Adda. 在菌株CH中未检测到mlrA、mlrB、mlrC 和 mlrD 这4个MC降解基因的同源基因. 这些结果表明， Paucibacter sp. CH菌降解MC的机制不同于已知的ACM-3962菌的降解机制.
关键词： 微囊藻毒素     降解     mlrA基因     Adda     Paucibacter    
Isolation, Identification and Characterization of a Microcystin-degrading Bacterium Paucibacter sp. Strain CH
YOU Di-jie, CHEN Xiao-guo, XIANG Hui-yi, OUYANG Liao, YANG Bing    
College of Resources and Environmental Engineering, Wuhan University of Technology, Wuhan 430070, China
Abstract: A bacterium capable of degrading microcystin (MC), strain CH, was isolated from the sediment of Lake Chaohu, China. Strain CH was tentatively identified as Paucibacter sp. based on the analysis of 16S rRNA gene sequences. Paucibacter sp. strain CH can use microcystin LR (MCLR) as the sole carbon and energy sources, and 11.6 μg·mL-1 of MCLR was degraded to below the detection limit within 10 hours with the first-order reaction rate constant of 0.242 h-1. The optimum temperature and initial pH for MC degradation were 25-30℃ and pH 6-9, respectively. A novel intermediate product containing the Adda residue was detected during the degradation of MCLR, which is different from those produced by strain ACM-3962, and Adda was recognized as the final product of the degradation process. Furthermore, no homologue to any of the four genes, mlrA, mlrB, mlrC and mlrD previously associated with the degradation of MCLR by strain ACM-3962 was found in strain CH. These findings suggest that Paucibacter sp. strain CH might degrade MC through a different pathway from that of strain ACM-3962.
Key words: microcystin     degradation     mlrA gene     Adda     Paucibacter    

微囊藻毒素(microcystin, MC)是由水华蓝藻产生的一类环状七肽物质,目前已经分离鉴定出90余种变体,其中MCLR是分布最广、 毒性最强的变体之一. 由于具有很强的肝毒性,水体中的MC污染已引起广泛关注,世界卫生组织(WHO)推荐饮用水中MCLR的浓度应不高于1.0 μg ·L-1 [1].

微生物降解是环境中MC自然归趋的主要途径之一[2]. 目前已经从环境样品中分离并鉴定出50余株MC降解菌,它们分布在变形菌门、 厚壁菌门和放线菌门,其中大部分属于变形菌门的鞘脂单胞菌科[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18]. Bourne等[19, 20]对1株鞘脂单胞菌科的MC降解菌ACM-3962降解MCLR的机制进行了研究,发现MlrA、 MlrB、 MlrC和MlrD这4种酶参与了该降解过程,它们分别由mlrA、 mlrB、 mlrC和mlrD这4个基因编码,并且发现mlrA是这一过程的关键基因,这是迄今为止探明的唯一一条MC降解途径. 目前,多数鞘脂单胞菌科的MC降解菌中检测到mlrA基因,说明这些细菌很可能与菌株ACM-3962具有相同的MC降解机制[3, 6,7,8 ,9,21]. 然而,在非鞘脂单胞菌科的MC降解菌中,却很少检测到mlrA基因[18, 22],由于缺乏相关研究,尚无法确定这些菌是否具有与菌株ACM-3962不同的降解机制.

本研究从巢湖沉积物中分离出1株高效MC降解菌,分析了温度和pH对该菌降解MC活性的影响,并根据降解产物和降解基因的检测结果对降解机制进行分析,以期深入了解MC的微生物降解过程,为应用微生物处理MC污染提供理论指导和技术支持.

1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器

实验用MCLR从室内培养的铜绿微囊藻中提取纯化,纯度大于90%. 沉积物样品采自巢湖表层沉积物. 甲醇和三氟乙酸均为色谱纯,其余试剂为分析纯. Taq酶购自天根生化科技,dNTP购自东洋纺生物科技.

Agilent 1100型高效液相色谱仪; LS-B50L型蒸汽灭菌器(滨江医疗设备); SW-CJ-1D型单人净化工作台(苏州净化); HZQ-F160A型恒温培养箱(上海一恒); Sartorius pH计; H-1850R台式高速冷冻离心机(湖南湘仪); Gel logic 2200 Pro型凝胶成像系统(Carestream); PCR仪(PTC-100, BIO-RAD).

1.2 培养基

无机盐液体培养基组成: K2HPO4 0.5 g, KH2PO4 0.5 g, MgSO4 ·7H2 O 0.5 g, NaCl 0.5 g, FeSO4 ·7H2 O 0.01 g,蒸馏水1000 mL,按实验要求调节pH值. 有机液体培养基组成：蛋白胨0.3 g,酵母粉0.3 g, MgSO4 ·7H2 O 0.05 g, CaCl2 0.03 g,蒸馏水100 mL,固体培养基加1.5%的琼脂. 培养基经121℃高温高压灭菌30 min.

1.3 MCLR的测定

样品经12000 r ·min-1离心10 min,上清液用HPLC法测定MCLR浓度. 色谱柱为Agilent TC C18分析柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm),流动相采用甲醇 ∶0.01%三氟乙酸=60 ∶40,流速为0.8 mL ·min-1, DAD检测波长为238 nm,光谱扫描范围200~300 nm,进样量10 μL.

1.4 MC降解菌的分离

沉积物样品在添加MCLR的无机盐培养基中连续富集培养3次,然后利用有机固体培养基进行稀释涂布分离,通过MCLR降解实验验证降解活性. 经过5次分离,获得1株MC降解菌CH,对该菌进行革兰氏染色分析和扫描电镜观察.

1.5 MCLR的降解及环境因素的影响

按10%的接种量将CH菌接种到含有MCLR的无机盐液体培养基中,于25℃条件下静置培养,每隔2 h取样, HPLC法检测MCLR浓度,分光光度计测定菌液的D600,所得结果用来绘制MCLR的降解曲线和CH菌的生长曲线. 通过改变培养温度,研究温度对MCLR降解的影响,利用NaOH和HCl调节反应体系的pH,研究初始pH对MCLR降解的影响,反应液初始D600为0.01.以上实验均设置3组平行.

1.6 CH菌16S rRNA基因的扩增及系统发育树

高温裂解法提取CH菌基因组DNA,利用细菌通用引物27F和1492R扩增16S rRNA基因. 产物切胶回收后AxyPrep试剂盒(Axygen)纯化,由上海美吉生物技术公司完成测序. 从NCBI上搜索与CH菌16S rRNA基因相似的序列,选择其中相似度高于90%的22条序列,利用Clustalx 1.83进行序列比对,采用邻接法(N-J)构建系统发育树(MEGA 4.1).

1.7 CH菌中MC降解基因mlr的检测

采用Saito等[3]报道的引物MF-MR和Ho等[6]报道的引物mlrBf1-mlrBr1、 mlrCf1-mlrCr1和mlrDf1-mlrDr1分别扩增CH菌中的mlrA、 mlrB、 mlrC和mlrD基因,同时选取1株含有mlr基因的Sphingopyxis sp. X20菌作为阳性对照. PCR反应条件参照文献[6],产物经0.7%的琼脂糖凝胶电泳分离,EB染色,紫外检测.

2 结果与讨论
2.1 MC降解菌的分离及鉴定

经过5次平板涂布分离,从巢湖沉积物中分离出1株MC高效降解菌,命名为CH. 该菌呈短杆状,大小为(1~2) μm×(0.1~0.3) μm,革兰氏染色呈阴性. 在30℃有机固体平板上培养48 h后,形成直径约为1 mm,白色、 圆形、 边缘整齐的菌落. 16S rRNA基因序列分析结果表明,CH菌与β变形菌纲的Paucibacter菌亲缘关系较近(图 1),并且与Paucibacter sp. 2B3菌株的16S rRNA基因序列相似度高达99%,初步确定该菌属于Paucibacter sp.. 目前,NCBI报道的Paucibacter菌共计21株,其中有13株来自芬兰的富营养化湖泊,它们均具有MC降解活性[23],其它8株菌则来自高海拔的冰河、 冰川等寒冷地区,这些菌是否具有MC降解活性,目前尚不清楚[24, 25]. 此外,在大气气溶胶[26]和我国北方寒冷地区的水处理装置中[27]也检测到了Paucibacter菌. 由此可见,目前已经检测到的Paucibacter菌主要存在于寒冷的生境中.

图 1 CH菌的系统发育树 Fig. 1 Neighbour-joining phylogenetic tree showing the position of isolate CH in relation to other closely related species

尽管MC降解菌广泛存在于河流、 湖泊、 水库等环境样品和水处理装置中,但是已经分离的MC降解菌种类仍然有限. 目前已经分离的50余株菌全部在变形菌门、 厚壁菌门和放线菌门的22个属中,且大部分属于变形菌门α变形菌纲的Sphingomonas、 Sphingosinicella和Sphingopyxis这3个属[3, 4, 5, 6, 7, 8, 9]. 然而,国内报道的属于α-变形菌纲的MC降解菌却很少[8, 21],大部分降解菌散布在变形菌门的β-变形菌纲和γ-变形菌纲以及厚壁菌门的Clostridia和Bacilli纲中[10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18], 并且也没有Paucibacter sp. 菌降解MC的报道. 目前,已经从巢湖水体和沉积物中分离出2株MC降解菌Kurthia sp. 菌株M9和Bacillus sp. 菌株M6[17, 28],它们均来自厚壁菌门,与本研究分离的变形菌门的Paucibacter sp. CH菌亲缘关系较远. 这些结果说明,巢湖水体中同时存在多种MC降解菌,这有利于MC的快速转化.

2.2 CH菌对MCLR的降解及其影响因素

图 2为CH菌于无机盐液体培养基中对MCLR的降解过程及其生长曲线. 在有CH菌存在条件下,11.6 μg ·mL-1的MCLR在10 h内降解到检测限以下,而无菌对照组中MCLR的浓度未发生明显变化,说明CH菌可以迅速降解MCLR. 随着MCLR的降解,CH菌的生物量明显增加,说明该菌可以利用MCLR作为唯一碳源和能源生长,其它MC降解菌也有类似的现象[5, 10, 13, 29],说明MC降解过程普遍与MC降解菌的生长有关. 拟合结果表明,MCLR的降解曲线可以用准一级反应速率方程描述,MCLR降解的反应速率常数为0.242 h-1,半衰期为2.86 h(R2=0.911).

图 2 CH菌对MCLR的降解Fig. 2 Biodegradation of MCLR by strain CH

不同温度下CH菌对MCLR的降解见图 3,在实验温度范围内, 8 μg ·mL-1的MCLR均在10 h内降解至检测限以下. 拟合结果表明,MCLR的反应速率常数k在15~35℃范围内随着温度的升高先增加后降低(0.192~0.441 h-1),在30℃时达到最大值0.441 h-1. t检验结果表明,除了25℃实验组的k值与30℃和35℃实验组间无显著差异外,其它各温度组之间k值均有显著差异(P <0.05). 这些结果说明,尽管在不同温度下MCLR完全降解所需时间相同,但是温度对降解速率仍有显著影响.

图 3 温度对CH菌降解MCLR的影响 Fig. 3 Effects of incubation temperature on the degradation of MCLR by strain CH

反应体系的初始pH值对CH菌降解MCLR也有重要影响(见图 4). 在中性pH值附近(pH 6~9), MCLR降解迅速, 8 μg ·mL-1的MCLR在10 h内可以降解至检测限以下,反应速率常数在0.163~0.343 h-1之间; 而较高pH 下(pH 10和11)降解缓慢, 10 h内MCLR只降解了54.4％和47.5％, k值也只有0.076 h-1和0.047 h-1; 酸性条件下(pH 5)降解更为缓慢, 48 h内MCLR只减少了16.7％, k值也只有0.002 h-1. 统计分析表明,除了pH为6的实验组与pH为8和9的实验组间反应速率常数k无显著性差异外,其它各实验组间都有显著差异(P<0.05). 类似的结果在其它MC降解菌中也有报道[12, 13, 18]. 尽管MC的微生物降解过程对pH值比较敏感,但是由于天然水体的pH普遍在6~9范围内,因此pH对天然水体中CH菌降解MC的影响不大.

图 4 初始pH对CH菌降解MCLR的影响 Fig. 4 Effects of initial pH on the degradation of MCLR by strain CH

2.3 CH菌降解MCLR的途径

在CH菌降解MCLR过程中,随着反应的进行,样品的色谱图中先后在5.7 min(产物A)和 7.2 min处出现2个产物峰(见图 5),且后者至48 h仍未发生降解. 这2个产物的光谱图与MCLR一样,都在238 nm处有特征吸收(图 5),说明它们都具有Adda基团. 进一步HPLC检测发现,出峰时间为7.2 min的产物与Adda在不同色谱条件下的保留时间均一致,光谱图也相同,所以初步判断该产物为Adda. 尽管此前报道的其它菌降解MC过程中也可以产生Adda,但它们很快被降解,因此降解过程中很难检测到Adda,只有利用MC降解菌粗酶降解MC时才能大量积累Adda[2, 30, 31]. HPLC检测结果表明, 在相同的色谱条件下,产物A(图 5)与ACM-3962菌降解MCLR的中间产物(线性MCLR和Adda-Glu-Mdha-Ala)[20]具有不同的出峰时间,说明CH菌降解MCLR的中间产物与ACM-3962菌的产物不同,目前正在对该产物进行质谱鉴定.

图 5 MCLR降解前后的HPLC图 Fig. 5 HPLC profiles of MCLR before and after biodegradation by strain CH

迄今为止,只有一条完整的MCLR降解途径被揭示,该过程由mlrA、 mlrB、 mlrC和mlrD 这4个基因编码的蛋白参与,它们通过水解肽键依次产生线性MCLR、 Adda-Glu-Mdha-Ala 和Adda 这3种中间产物[7, 19, 32]. 与这一已知的降解途径不同,CH菌降解MCLR最终积累产物Adda,说明该菌对Adda没有降解能力,并且,该过程产生的中间产物A也不同于已报道的中间产物,说明CH很可能具有新的降解途径.

为了进一步验证这一假说,利用文献[3, 6]报道的引物对CH菌中的mlrA、 mlrB、 mlrC和mlrD 这4个基因进行了检测,结果如图 6所示. 在阳性对照样品(X20菌)中扩增出了全部4个基因,而CH菌中4个基因均未检测到. 通过降低退火温度等方法对PCR反应条件进行了优化,但CH菌中仍然无法扩增出mlr基因,说明CH菌中很可能含有新的MC降解基因. 这些结果表明,CH菌降解MCLR的机制与已知的ACM-3962菌[6, 19] 不同. 为了揭示CH菌降解MCLR的机制,目前正在构建基因文库,筛选MC降解基因.

图 6 CH菌中MC降解基因mlr的检测Fig. 6 Detection of mlr gene fragments in strain CH

目前为止,检测到含有mlr基因的MC降解菌大部分集中在α-变形菌纲,而β-变形菌纲和γ-变形菌纲,以及厚壁菌门和放线菌门的MC降解菌多数未检测或未检测到mlr基因. 本研究结果表明,这些不含mlr基因的MC降解菌很可能具有与ACM-3962菌不同的MC降解途径,说明环境中可能存在多种MC降解途径,因此,有必要对这些新的降解途径进行深入研究.

3 结论

(1)从巢湖沉积物中分离出1株高效MC 降解菌Paucibacter sp. CH菌. 该菌呈短杆状,革兰氏染色阴性,可以利用MCLR做为唯一碳源和能源,10 h内可将11.6 μg ·mL-1的MCLR降解到检测限以下.

(2)温度和pH对CH菌降解MCLR具有显著影响,pH 在6~9范围,温度在25~35℃范围有利于MCLR的降解.

(3)CH菌降解MCLR的机制与已报道的ACM-3962菌降解MC的机制不同,CH菌中不含mlr基因,MCLR的降解中间产物不同于ACM-3962菌的中间产物,并且降解过程最终积累Adda.

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