环境科学  2014, Vol. 35 Issue (1): 292-298   PDF    
引用本文
胡晓娜, 张淑娴, 陈彩东, 刘惠君. 异丙甲草胺与锌共存对斜生栅藻毒性手性差异影响[J]. 环境科学, 2014, 35(1): 292-298.
HU Xiao-na, ZHANG Shu-xian, CHEN Cai-dong, LIU Hui-jun. Influence of the Coexistence of Zn2+ on the Enantioselective Toxicity of Metolachlor to Scenedesmus obliquus[J]. Environmental Science, 2014, 35(1): 292-298.
异丙甲草胺与锌共存对斜生栅藻毒性手性差异影响
胡晓娜, 张淑娴, 陈彩东, 刘惠君    
浙江工商大学环境科学与工程学院, 浙江省固体废物处理与资源化重点实验室, 杭州 310012
收稿日期: 2013-4-15; 修订日期: 2013-5-27.
基金项目： 国家自然科学基金项目（21377115）；浙江工商大学研究生科研创新基金项目（1260XJ1512147）
作者简介：胡晓娜（1988~），女，硕士研究生，主要研究方向为污染物环境生态毒理，E-mail：731696698@qq.com
通讯联系人,E-mail:lhj@mail.zjgsu.edu.cn
摘要：为评价重金属与手性农药共存的生物选择性毒性，采用毒性试验标准方法研究了Rac-、S-异丙甲草胺单独及与锌共存对斜生栅藻的手性毒性差异. 结果表明，Zn2+存在条件下Rac-、S-异丙甲草胺对斜生栅藻的生长趋势影响与除草剂单独作用时的趋势基本相同，Zn2+的存在降低了高浓度除草剂对斜生栅藻的生长抑制作用，处理初期（24 h）0.30 mg·L-1Rac-和S-异丙甲草胺单独对斜生栅藻生长的抑制率分别为49.61%和59.73%，与Zn2+联合作用其抑制率分别为38.41%和42.52%. Zn2+的存在增加了Rac-和S-异丙甲草胺对斜生栅藻的立体选择性毒性差异，使S-异丙甲草胺急性毒性增大的程度大于Rac-异丙甲草胺毒性的增加；与Zn2+的联合毒性作用类型表现为除草剂在低浓度下为部分相加作用，高浓度下为拮抗作用；除草剂单独及与Zn2+联合作用处理96 h后的斜生栅藻叶绿素含量变化与其生长趋势基本一致.
关键词： 斜生栅藻     Zn2+     手性差异     半数效应浓度     叶绿素    
Influence of the Coexistence of Zn2+ on the Enantioselective Toxicity of Metolachlor to Scenedesmus obliquus
HU Xiao-na, ZHANG Shu-xian, CHEN Cai-dong, LIU Hui-jun     
Zhejiang Provincial Key Laboratory of Solid Waste Treatment and Recycling, College of Environmental Science and Engineering, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310012, China
Abstract: To evaluate the enantioselective toxicity of chiral pesticide coexisting with heavy metal, the enantioselective toxicity of Rac-, S-metolachlor alone and coexisting with Zn2+ on Scenedesmus obliquus was studied by using standard toxic testing method. The results showed that the trend of the enantioselective toxicity of Rac- and S-metolachlor coexisting with Zn2+ was similar to that of Rac- and S-metolachlor alone. The growth inhibition rate of Scenedesmus obliquus was decreased by the coexistence of Zn2+ with high concentrations of metolachlor. The inhibition rates with 0.30 mg·L-1 Rac- and S-metolachlor alone at 24 h were 49.61% and 59.73%, and in the coexistence of Zn2+ the values were 38.41% and 42.52%, respectively. The enantioselective toxicity of Rac- and S-metolachlor was expanded and the toxicity of S-metolachlor increased greater than that of Rac-metolachlor. The coexistence of Zn2+ showed partial increase in toxicity of metolachlor in low concentrations, while there was antagonistic effect in high content of metolachlor. The trend of Chlorophyll content of Scenedesmus obliquus at 96 h was in accordance with the growth inhibition.
Key words: Scenedesmus obliquus     Zn2+     enantioselective toxicity     EC50     chlorophyll    

由于手性农药的广泛使用及其对映体环境归趋的差异性和立体选择性毒性，手性农药的环境选择性毒理研究已成为研究热点[1]. 异丙甲草胺是手性农药对映体纯的研究与应用最成功的一例，有两种商品化的异丙甲草胺，一种是外消旋异丙甲草胺(Rac-metolachlor, Racmt)，又称都尔、 稻乐思; 另一种是富集了S-对映体的产品S-异丙甲草胺(S-metolachlor, Smt)，又称精异丙甲草胺或金都尔. 关于Rac-和S-异丙甲草胺环境行为及其施用后产生的对映体生态安全差异研究已受到关注[2, 3, 4, 5, 6, 7]，然而关于手性农药与重金属共存的生物选择性毒性差异鲜有报道.

二价锌离子(Zn2+)既是生物代谢的微量营养元素，又是高毒重金属. 高浓度Zn2+会抑制藻类生长[8, 9, 10]，影响光合作用，使叶绿素含量下降，类胡萝卜素与叶绿素的比率失调，藻类渗透压增高，电解质漏失，最终导致藻类形态发生变异[11].

水藻是水生生态系统中最常见的生物，由于其对毒物敏感、 易获得、 个体小、 繁殖快，在较短时间内可得到化学物质对藻类许多世代及种群水平的影响评价，因此常被用来监测和评价水体环境质量变化和水体污染状况[12, 13]. 本研究选择斜生栅藻为指示生物，从急性毒性和叶绿素含量影响分析并比较了Rac-及S-异丙甲草胺单独及与锌联合作用对斜生栅藻的影响，并探讨了Zn2+对除草剂手性毒性差异性的影响，以期更准确地评估污染物生态风险性并为手性农药的合理使用提供理论依据.

1 材料与方法
1.1 实验材料

斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)购自中国科学院水生生物研究所，培养基采用水生4号(HB-4)人工培养液; Rac-异丙甲草胺(96%)购自杭州庆丰农药厂，S-异丙甲草胺(96%)购自先正达(瑞士)公司; 氯化锌(ZnCl2)购自上海生工生物工程有限公司; 其他试剂、 药品均为分析纯.

1.2 实验方法
1.2.1 斜生栅藻的培养

斜生栅藻置于智能型可编程光照培养箱恒温光照培养，用4层纱布封口，培养温度为24.0℃±1.0℃，光照63 μmol ·(m2 ·s)-1连续静置培养，设置光暗比为16 h ∶8 h，每天定时摇动3~5次，当进入对数生长期(藻密度约为5×105~6×105 个 ·mL-1)时转接至下一代，镜检细胞正常.

1.2.2 急性毒性试验方法

将处于对数生长期的斜生栅藻100 mL接种到250 mL锥形瓶中，藻密度为7.5×105个 ·mL-1，设置3个平行. Rac-和S-异丙甲草胺浓度设置为0、 0.050、 0.075、 0.10、 0.15、 0.20和0.30 mg ·L-1，Zn2+浓度为0.15 mg ·L-1(本实验得到Zn2+单独作用斜生栅藻时的EC50, 48 h、 EC50, 72 h和EC50, 96 h值分别0.14、 0.15和0.17 mg ·L-1). 进行异丙甲草胺单独及与锌联合培养，用可见光分光光度计(721E)分别于24、 48、 72、 96 h测定藻液在680 nm处的吸光值.

1.2.3 叶绿素含量测定方法

取处理96 h的藻液，用90%的丙酮在低温暗处浸提24 h，取上清液用紫外可见分光光度计(TU-1901)测定663和645 nm处吸光值，按照Mackinney公式计算叶绿素a(Chl a)和叶绿素b(Chl b)的含量[14]，公式如下：

1.2.4 数据统计与分析

采用SPSS 15.0进行数据分析与处理，对藻细胞叶绿素含量的差异性用方差检验，并用Duncuns New Multiple Test做浓度之间的多重比较，显著性水平为P<0.05. 异丙甲草胺单独及与锌联合作用对斜生栅藻的生长抑制率表达为：100%×(对照吸光值-处理吸光值)/对照吸光值，采用Logistic模型[15]计算其半数效应浓度EC50.

2 结果与讨论
2.1 Zn2+存在下Rac-、 S-异丙甲草胺对斜生栅藻的急性毒性影响

采用Logistic模型拟合得Zn2+(0.15 mg ·L-1)存在条件下Rac-和S-异丙甲草胺对斜生栅藻生长抑制率的最佳浓度-效应曲线，同时得到相应EC50值(图 1和图 2). 可以看出，Rac-和S-异丙甲草胺对斜生栅藻的生长抑制率随着除草剂浓度的增大而升高，EC50值随暴露时间的延长而减小. 低浓度(<0.15 mg ·L-1)情况下，Rac-和S-异丙甲草胺对斜生栅藻的生长抑制作用较小， S-异丙甲草胺的毒性作用显著高于Rac-异丙甲草胺，96 h时0.075 mg ·L-1 Rac-和S-异丙甲草胺对斜生栅藻的抑制率分别为9.12%和35.13%，两者相差约3.9倍. 在浓度＜0.075 mg ·L-1下，24、 48、 72和96 h时0.050 mg ·L-1 Rac-异丙甲草胺对斜生栅藻的抑制率随着暴露时间的延长分别为5.53%、 1.09%、 2.74%和0.54%，S-异丙甲草胺分别为19.25%、 7.76%、 6.79%和6.20%，随着暴露时间的延长斜生栅藻表现出一定的恢复能力. 这与Liu等[5]研究发现小球藻在低浓度异丙甲草胺(0.01 mg ·L-1和0.04 mg ·L-1)作用下随时间的延长生长恢复一致. 在浓度≥0.075 mg ·L-1时，Rac-和S-异丙甲草胺对斜生栅藻的生长抑制率随着暴露时间的延长而增大，0.15 mg ·L-1 Rac-异丙甲草胺对斜生栅藻的抑制率分别为28.04%、 28.72%、 55.84%和67.07%，S-异丙甲草胺分别为47.56%、 85.87%、 89.86%和91.90%.

图 1 Zn2+存在条件下Rac-异丙甲草胺对斜生栅藻的抑制作用

Fig. 1 Concentration-response fitting curve of Rac-metolachlor in the presence of Zn2+

图 2 Zn2+存在条件下S-异丙甲草胺对斜生栅藻的抑制作用

Fig. 2 Concentration-response fitting curve of S-metolachlor in the presence of Zn2+

Zn2+存在时，Rac-和S-异丙甲草胺对斜生栅藻的毒性作用趋势与除草剂单独作用时的趋势基本相同. 随着培养时间的延长，斜生栅藻在低浓度异丙甲草胺与Zn2+联合作用下也表现出一定的恢复能力. 低浓度除草剂与Zn2+共存时对斜生栅藻的生长抑制率比除草剂单独作用时的抑制率大，但Zn2+的添加使高浓度除草剂抑制率下降. 处理初期(24 h)，各处理浓度Rac-异丙甲草胺单独作用对斜生栅藻的抑制率分别为5.35%、 6.27%、 8.04%、 28.04%、 44.77%和49.61%，与Zn2+联合作用对斜生栅藻的抑制率为28.33%、 29.08%、 26.84%、 29.08%、 33.56%和38.41%(图 1); 各浓度S-异丙甲草胺单独作用对斜生栅藻的抑制率分别为19.25%、 21.43%、 35.79%、 47.56%、 48.92%和59.73%，与Zn2+联合作用对斜生栅藻的抑制率分别为21.61%、 27.21%、 29.45%、 33.56%、 35.42%和42.52%(图 2)，Zn2+的存在降低了高浓度除草剂对斜生栅藻生长的抑制作用.

2.2 Zn2+与Rac-、 S-异丙甲草胺联合毒性分析

评价联合毒性的方法有很多，如毒性单位法、 相加指数法等. 本研究采用毒性单位法对除草剂与Zn2+的联合毒性进行评价，毒性单位指当实验溶液的毒物浓度等于该毒物对某种水生生物的半数效应浓度(EC50)时，实验溶液对水生生物的毒性强度为一个毒性单位[16]. 根据这个原理，混合物中第i组分的毒性单位(TUi)可表示为:

式中, ci指i组分在混合物中的浓度，EC50, i指i组分单独作用时的半致死浓度(或半数有效浓度); TUi, max指混合物中毒性单位最大值. 由Zn2+和Rac-、 S-异丙甲草胺单独作用的EC50值计算M和M0值，根据M和M0值的大小来评价联合作用的类型(表 1和表 2). 培养48 h Rac-及S-异丙甲草胺与Zn2+的联合作用类型均为拮抗作用; 培养后期(72 h和96 h)，Rac-、 S-异丙甲草胺与Zn2+的联合作用类型均表现为除草剂在低浓度下的联合作用为部分相加作用，高浓度下为拮抗作用.
表 1 联合毒性评价方法的具体评价标准

Table 1 Standard of the evaluation methods for joint toxicity

表 2 Rac-、 S-异丙甲草胺与Zn2+的联合毒性分析

Table 2 Joint toxicity of Rac- and S-metolachlor with Zn2+
2.3 Zn2+存在对Rac-及S-异丙甲草胺对映体选择性差异的影响

为了说明Zn2+存在对异丙甲草胺对映体选择性差异的影响，通过分析Rac-及S-异丙甲草胺的半数有效浓度比值(enantioselective toxicity，ET)来表征异丙甲草胺的潜在立体选择性毒性：

式中，EC50S、 EC50R、 EC50Rac分别指S-、 R-及Rac-异丙甲草胺对斜生栅藻的EC50值，i和j (i +j=1)分别指EC50S和EC50R对EC50Rac的贡献率[17].

当ET>1时，说明S-对映体的潜在毒性较大; 反之，R-对映体的毒性较大; 当ET=1时，对映体间不存在毒性差异.

Rac-和S-异丙甲草胺对斜生栅藻的ET值分别为1.67(48 h)、 1.69(72 h)和1.65(96 h)，均大于1，说明两者对斜生栅藻的急性毒性存在差异，毒性主要来自S-异丙甲草胺. 随着暴露时间的延长，ET值变化不明显，说明Rac-和S-异丙甲草胺的立体选择性毒性随时间变化不大. Zn2+存在条件下，Rac-和S-异丙甲草胺对斜生栅藻的ET值分别为2.20(48 h)、 2.62(72 h)和2.00(96 h). 进入环境的手性物质被生物摄取后，其不同对映体潜在的生物效应大都具有对映体选择性差异[1, 18, 19]，Wen等[20]研究报道铜存在条件下除草剂2, 4-滴丙酸的毒性发生了对映选择性反转. 本研究表明Zn2+的存在没有导致对映体毒性反转，但是增加了Rac-和S-异丙甲草胺对斜生栅藻的立体选择性毒性差异，Zn2+的存在使S-异丙甲草胺急性毒性增大的程度大于Rac-异丙甲草胺毒性的增加.

2.4 Zn2+存在下Rac-、 S-异丙甲草胺对斜生栅藻叶绿素含量的影响

在光合作用中叶绿素占有非常重要的地位，Chl a或总叶绿素含量在许多研究中常被作为测定光合作用的指标，而Chl b含量可能会随着光密度、 光范围的变化而变化. Zn2+(0.15 mg ·L-1)存在条件下Rac-、 S-异丙甲草胺对斜生栅藻叶绿素含量影响见表 3.

表 3 处理96 h后斜生栅藻的Chl a和Chl b的浓度及其含量比 1)

Table 3 Chl a and Chl b concentration and the Chl a/Chl b ratio of S. obliquus after 96 h treatment

结果表明，除草剂单独处理96 h后的斜生栅藻叶绿素含量变化与其生长趋势基本一致. 处理组的Chl a、 Chl b明显低于空白组，其含量与除草剂浓度呈负相关效应. S-异丙甲草胺对斜生栅藻Chl a和Chl b含量的影响显著于Rac-异丙甲草胺的影响(P<0.05)，与对照相比，0.10、 0.20 mg ·L-1 Rac-异丙甲草胺分别使Chl a含量减少了26.2%、 69.4%，S-异丙甲草胺分别使Chl a减少了72.0%、 94.1%; 研究表明斜生栅藻Chl b含量对异丙甲草胺较为敏感，0.10 mg ·L-1； 0.20 mg ·L-1 Rac-异丙甲草胺分别使Chl b含量减少了34.5%、 79.5%，S-异丙甲草胺分别使Chl b减少了79.3%、 94.5%，说明S-异丙甲草胺对藻光合作用影响更大，毒性更强. 此结果与Liu等[5]关于异丙甲草胺对蛋白核小球藻的毒性研究一致. 与对照相比，Rac-异丙甲草胺处理组Chl a和Chl b含量比(Chl a/b)增大，随浓度呈上升趋势; S-异丙甲草胺处理组Chl a/b比值先上升后又下降，研究报道Chl a/b的上升意味着生物于逆境下抗性的增强[21]. Zhao等[22]报道，人工增强UV-B辐射下，喜树叶片中叶绿素含量与对照相比明显降低，但Chl b含量的变化更为显著.

除草剂与Zn2+联合作用的斜生栅藻叶绿素含量变化与除草剂单独作用时变化一致. Zn2+存在条件下，处理组的Chl a、 Chl b明显低于空白组和相同浓度除草剂单独处理组含量，说明联合作用对斜生栅藻叶绿素含量的影响大于除草剂单独作用的影响. S-异丙甲草胺与Zn2+联合作用对Chl a和Chl b含量的影响显著于Rac-异丙甲草胺(P<0.05)，相比较空白组，0.10、 0.20 mg ·L-1 Rac-异丙甲草胺分别使Chl a含量减少了47.6%、 84.8%，S-异丙甲草胺分别使Chl a减少了86.1%、 95.6%; 0.10、 0.20 mg ·L-1； Rac-异丙甲草胺分别使Chl b含量减少了67.4%、 88.1%，S-异丙甲草胺分别使Chl b减少了87.7%、 94.7%. Zn2+存在条件下，Rac-和S-异丙甲草胺处理组Chl a/b均先增大后降低. 0.10、 0.20 mg ·L-1 S-异丙甲草胺处理组Chl a/b均小于1，说明Chl a含量小于Chl b含量，S-异丙甲草胺与Zn2+联合作用抑制斜生栅藻Chl a含量较多于Chl b含量. Moyen等[23]和Xia等[24]研究报道锶、 铜胁迫下，Chl a含量变化比Chl b含量更为敏感. 本实验在有Zn2+存在条件下，Chl a含量变化比较敏感. Chl b含量的相对稳定从而导致Chl a/b比值的降低可能与叶黄素的稳定性相关; 反之，Chl a含量的相对稳定从而导致Chl a/b比值的升高可能与β-类胡萝卜素的稳定性相关[25]. 异丙甲草胺与Zn2+联合作用时Chl b含量较Chl a含量稳定，Chl a/b比值下降，说明异丙甲草胺与Zn2+联合作用对斜生栅藻叶黄素的影响较明显于β-类胡萝卜素.

3 结论

(1)异丙甲草胺对斜生栅藻的急性毒性随着除草剂浓度的上升和暴露时间的延长而增大，存在剂量效应和时间效应关系; Zn2+存在条件下，Rac-、 S-异丙甲草胺对斜生栅藻的毒性作用趋势与其单独作用时的趋势基本相同，Zn2+的存在降低了高浓度除草剂对斜生栅藻生长的抑制作用.

(2)培养48 h时，Rac-及S-异丙甲草胺与Zn2+联合作用类型均为拮抗作用，72 h和96 h时与Zn2+的联合作用类型均表现为除草剂在低浓度下的联合作用为部分相加作用，高浓度下为拮抗作用.

(3)Rac-和S-异丙甲草胺对斜生栅藻的急性毒性存在差异，毒性主要来自S-异丙甲草胺. Zn2+的存在没有导致对映体毒性反转，但是增加了Rac-和S-异丙甲草胺对斜生栅藻的立体选择性毒性差异，Zn2+的存在使S-异丙甲草胺急性毒性增大的程度大于Rac-异丙甲草胺毒性的增加.

(4)处理96 h后异丙甲草胺对斜生栅藻叶绿素含量的影响存在浓度-效应关系，叶绿素含量变化与其生长趋势基本一致. Zn2+存在条件下，Rac-和S-异丙甲草胺处理组Chl a和Chl b含量比(Chl a/b)均先增大后降低.

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